이 프로토콜을 통해 우리는 휘발성 대사 산물을 쉽게 농축하고 식별 할 수 있으며 다양한 생물학적 샘플에서 미생물 유기체에서 휘발성 물질을 적극적으로 생산할 수 있습니다. VASE는 저풍부 휘발성 물질을 집중시키는 사용자 친화적 인 방법입니다. 필요한 것은 거의 진공 상태의 샘플이며 물리학이 나머지를 수행하도록하십시오.
임상 샘플의 휘발성 분석에 대한 접근은 다수의 상이한 질병 상태에서의 대사 바이오마커 발견에 중요한 함의를 갖는다. 예를 들어, 병원체 운전 및 감염 또는 항균 요법의 성공은 타액, 객담 또는 호흡 샘플의 휘발성 분석으로 검출 될 수 있습니다. 분변 샘플을 준비하려면 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 100 밀리그램의 분변에 1 밀리리터의 탈이온수를 넣고 3 분 동안 와류하십시오.
사용하지 않을 때는 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 20 밀리몰 13C 포도당 또는 30 % 중수소의 BHI가있는 BHI 배지 485 밀리리터를 분변 및 물 혼합물 15 마이크로 리터에 첨가하여 샘플의 최종 부피가 500 마이크로 리터가되도록하십시오. 기술 삼중으로 샘플을 준비하십시오.
하수 샘플을 준비하려면 1 밀리리터의 총 부피에 대해 13C 포도당 또는 30 % 중수소가있는 BHI 배지 500 마이크로 리터에 500 마이크로 리터의 하수를 첨가하십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 타액 샘플을 준비하려면 50 마이크로 리터의 타액을 13C 포도당이있는 BHI 배지 500 마이크로 리터 또는 30 % 중수소에 첨가하여 총 부피 550 마이크로 리터.
샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 가래 샘플을 준비하려면 가래 15 마이크로 리터를 바이알에 넣으십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
차가운 접시에 빈 VOA 바이알을 놓고 차가운 접시를 생물 안전 후드의 얼음 위에 놓습니다. 5600 SPEU를 켜고 필요한 온도로 조정하십시오. 샘플, 반복실험 및 HSP ID에 따라 20밀리리터 VOA 바이알에 라벨을 붙이고, 얼음 위에서 바이알 외부에 결로가 형성될 경우 물에 저항하는 내수 마커를 사용합니다.
생물 안전 후드 내부에서 바이알의 흰색 캡을 풀고 신속하게 피펫 샘플을 바이알에 넣고 뚜껑 라이너, 블랙 캡 및 HSP를 조립하십시오. 샘플 및 HSP가 들어있는 바이알을 다시 차가운 플레이트 위에 놓습니다. 모든 샘플이 유리 바이알에 준비되면 진공 펌프를 켜고 바이알을 진공 아래에 놓고 진공 소스를 제거하십시오.
압력 게이지를 사용하여 모든 샘플을 진공 하에 놓은 후 압력을 다시 확인하십시오. 바이알이 새는 경우 뚜껑이 단단히 조여져 있고 HSP 및 뚜껑 라이너의 흰색 O 링이 올바르게 제자리에 있는지 확인하십시오. 바이알을 200RPM에서 교반하면서 최적화된 시간과 온도를 위해 SPEU에 넣습니다.
섭씨 70도에서 1시간 동안 배양물을 추출하고 섭씨 37도에서 18시간 동안 분변, 하수, 타액 및 객담 시료로 안정한 이소타입 프로빙 실험을 추출한다. 추출 기간이 완료된 후 사용하기 위해 차가운 접시를 영하 80도에 놓습니다. 추출이 완료되면 샘플을 차가운 접시에 15 분 동안 올려 HSP 및 바이알 헤드 스페이스에서 수증기를 뽑은 다음 HSP를 슬리브로 옮깁니다.
Entech 소프트웨어에서 샘플 시퀀스를 설정합니다. 프로그램을 열고 계측기 드롭다운 메뉴의 오른쪽에 있는 옵션에서 5800 및 시퀀스를 선택합니다. 시퀀스 테이블을 저장하고 왼쪽에서 실행을 선택한 다음 빈 HSP가 탈솔버가 아닌 경우 Desorber에서 공백으로 시작을 선택합니다.
HSP는 시퀀스의 각 샘플에 대해 SPR에 의해 처리됩니다. SPR을 예열하십시오. SPR이 모든 샘플을 자동으로 실행하도록 허용합니다.
GC-MS 측의 시퀀스는 자동으로 별도의 파일에 데이터를 기록합니다. 보정을 선택한 다음 외부 표준 컴파운드 아래에서 컴파운드, 이름 및 삽입 컴파운드 편집을 선택하여 처리 방법에 피크를 추가합니다. 화합물의 이름, 체류 시간 및 양자 신호 표적 이온을 추가하십시오.
75% 이상의 확률을 갖는 화합물을 포함하는 세 개의 가장 큰 피크를 추가하여 화합물의 각 식별 이온의 정렬이 피크의 중심 내에 위치하도록 합니다. 확인을 선택한 다음 방법 및 저장을 선택하여 저장합니다. 프로세스 메소드가 설정되면 정량 및 계산으로 진행한 다음 결과 보기 및 QEDIT 수량 결과로 진행하여 데이터를 정량화합니다.
여기에서, 진공 보조 흡착제 추출에 이어 GC-MS에서 열 탈착하여 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 통해 활발히 생산된 휘발성 물질을 확인했다. 모노 및 공동 배양은 박테리아 종 포도상 구균, 슈도모나스 aeruginosa, 및 acinetobacter baumannii로 구성되었습니다. 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 24시간 및 48시간 시점에서 모노- 및 공동-배양물로부터 검출되었다.
중수소에 비해 완전히 표지된 휘발성 분자에 13C가 더 많이 혼입되었다. 13C를 모든 분변, 하수 및 타액 샘플에 대해 2-부타논, 3-히드록시, 2,3-부탄디온 디아세틸, 아세트산 및 페놀에 혼입시켰다. 아세톤, 부탄산 및 프로파노산은 타액 및 하수구에서 표지된 것으로 검출되었다.
반면 디메틸 트리설파이드 및 디술피드 디메틸은 분변 및 타액 샘플 둘 다에서 풍부하였다. 휘발성 물질을 1-프로판올, 2-부타논, 벤조페논, 에탄올 및 메틸티올 아세테이트는 하수에만 농축하고 타액에서 2,3-펜탄디온을 농축하였다. 중수소는 타액 또는 하수 샘플로부터 휘발성 아세트산, 벤즈알데히드, 4-메틸디메틸트리설파이드 및 페놀에 혼입되었다.
아세트산, 디메틸트리설파이드, 아세톤, 및 프로판올 2-메틸은 배양되지 않은 객담 샘플보다 배양된 객담 샘플에서 더 풍부하였다. 변이체, PERMANOVA의 순열 다변량 분석을 낭포성 섬유증 객담 샘플로부터의 휘발성 풍부도의 브레이-커티스 거리 매트릭스 상에서 수행하였다. 우리는 샘플을 기증 한 피험자가 13C 표지 된 배양 객담의 변이의 51 %와 배양되지 않은 가래의 변이의 33 %를 설명한다는 것을 발견했습니다.
여기에서, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 일곱 명의 사람들로부터 수집된 배양된 객담 샘플로부터의 휘발성 물질에서 13C 글루코스로 안정한 동위원소 표지의 성공이 보여진다. 대부분의 샘플에 대해 더 높은 13C 혼입을 갖는 휘발성 물질은 패널 5A에 도시되어 있고, 대부분의 객담 샘플에서 더 낮은 퍼센트 13C 혼입을 갖는 휘발물질은 패널 5B에 있고, 가래 샘플의 소수에서 더 낮은 13C 퍼센트 변환을 갖는 분자는 패널 5C에 도시되어 있다. 항상 약 분 후에 바이알 압력을 다시 확인하십시오.
깨진 진공은 VASE 방법의 감도와 속도를 무너뜨립니다. 이 절차에 따라, 안정한 동위원소 프로빙이 수행되면, DNA는 휘발성 분자의 생산에 기여했을 수 있는 미생물 유기체 또는 종을 확인하기 위해 나머지 물질로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 동위원소 프로빙이 없는 모든 샘플 유형으로부터 휘발성 물질을 검출하는데 또한 유용하다.
감도와 낮은 샘플 부피의 장점으로 많은 응용 프로그램이이 기술의 이점을 누릴 수 있습니다.
