椎间盘从胚胎发育到退化的光学切片和可视化

椎间盘退行性变导致高度损伤和疼痛。我们的协议使我们能够研究形态学上的椎间盘发育及其变性的变化。致密的一型胶原蛋白网络通常难以通过显微镜分析椎间盘。

通过光学切片，我们可以研究不同组织中软骨细胞的3D排列。首先将术中获得的椎间盘或IVD样品放入DMEM中，补充2%体积的青霉素 - 链霉素和1.2%体积的两性霉素B，收集后立即将IVD样品储存在4摄氏度，直到进一步处理。如果冷冻解冻，则在室温下解冻人类IVD样品，并根据微观特性（例如：大学密度和方向）确定人类IVD组织的起源。

要收集牛盘组织，取由IVD及其两个相邻椎骨组成的运动段，并使用15号手术刀片，从软骨下骨上解剖整个牛盘，翻转椎间盘到达中心区域。在识别软骨的不同区域后，使用编号为20或22的手术刀片从整个椎间盘中切出感兴趣的区域。来自冠臀长度小于20厘米的牛胚胎的IVD应不进行解剖。

如手稿中所述，对组织进行了脱钙。如果 20 号针穿透椎间盘组织，或者如果适用，椎骨没有明显的阻力，则确认脱钙成功。在PBS中将组织样品在PBS中十倍体积的4%甲醛溶液中精确四十倍，在4摄氏度下过夜。

第二天，将组织置于水溶性包埋介质中，放在冷冻机旋钮上，这样就会正常产生垂直切割胶原的轴向平面或平面。使用标准冷冻切片机，在人类样品中以70微米的厚度和在牛样品中以40微米的厚度切割嵌入的组织。在用PBS冲洗切片三次之前，收集载玻片上的切片，添加合适的荧光染料，然后安装介质，并用盖玻片覆盖切片。

通过启动结构照明装置，将带有染色组织切片的载玻片放在荧光显微镜的样品架上，使用荧光滤光片和足够的照明进行单视场成像。使用与荧光显微镜兼容的图像优化软件，通过优化强度和亮度来处理图像。要将部分作为一个整体可视化，请使用镶嵌成像技术，方法是从工具栏面板打开 60 个采集设置，然后调整镶嵌寄存器中的镶嵌设置。

为此，请定义稍后应合并到一个概视图图像中的视野图像的列数和行数，请按设置并调整各个图块的焦点校正。通过优化强度和亮度对图片进行后期处理。要分析空间软骨细胞组织，请使用软件中包含的3d功能，通过使用开始/停止按钮调整Z-stack设置，定义扫描参数，如Z轴上的开始和停止位置以及切片距离。

识别单个细胞模式并使用细胞计数插件对细胞模式进行定量分析，通过将计数的细胞除以所选感兴趣区域的大小来计算细胞密度。IVD的结构及其在环中致密的胶原纤维网络和较软的核可以在轴向和矢状平面拍摄的马赛克图像中识别。在马赛克图像的放大区域中，注意到软骨细胞的不同空间组织模式，例如单细胞，成对和弦。

对牛环状纤维化不同发育和成熟阶段的研究显示，胚胎盘发育过程中细胞密度持续下降。另一方面，在变性期间在成人人盘中观察到细胞密度和簇形成的增加。IVD发育早期牛环纤维化和牛髓核细胞密度迅速下降，直至出生。

通过对具有Epitome的IVD进行通道成像，可以可视化空间模式（例如细胞质和细胞核）的3D结构，在完整的IVD单个以及成对的软骨细胞中被发现。而在退化的肛门细胞簇中发现了。最具挑战性的部分是将组织分配到其原点并校正嵌入以进行切片。

这对于获得可靠的结果至关重要。正确解剖和选择来自不同阶段和起源的IVD组织使我们能够通过进一步的生化和生物力学分析（例如ELISA或原子力显微镜）来深化分析。