Intervertebral Disk dejenerasyonu yüksek derecede bozulmaya ve ağrıya yol açar. Protokolümüz morfolojik olarak disk gelişimini ve dejenerasyondaki değişikliklerini araştırmamızı sağlar. Yoğun kollajen tip bir ağ genellikle Intervertebral Disc'in mikroskopi ile analizini zorlaştırır.
Optik kesit ile farklı dokulardaki kondrositlerin 3D düzenini araştırabiliriz. Ameliyat içi elde edilen, Intervertebral Disc veya IVD örneklerini DMEM'e Penisilin-Streptomisin hacmine göre%2 ve Amphotericin B hacmine göre %1,2 hacim ile desteklenmiş olarak yerleştirerek başlayın, hemen toplama sonrası, IVD örneklerini bir sonraki işleme kadar dört santigrat derecede saklayın. Dondurulursa, insan IVD örneklerini oda sıcaklığında çözün ve insan IVD dokusunun kökenini;kolej yoğunluğu ve oryantasyonu gibi mikroskobik özelliklere göre tanımlayın.
Sığır diski dokusunu toplamak için, iki bitişik omur ile IVD'den oluşan hareket segmentini alın ve 15 numaralı cerrahi bir bıçak kullanarak, tüm sığır diskini subkondral kemikten parçalara ayırın, ortalanan bölgelere ulaşmak için diski çevirin. Kıkırdağın farklı bölgelerini belirledikten sonra, tüm diskten ilgi alanını kesmek için 20 veya 22 numaralı bir cerrahi bıçak kullanın. 20 santimetreden küçük bir taç-rump uzunluğuna sahip sığır embriyolarından alınan IVD'ler diseksiyon olmadan işlenmelidir.
El yazmasında açıklandığı gibi dokunun kireçden arındırılması gerçekleştirildi. 20 kalibrelik bir iğne disk dokusuna nüfuz ederse veya omurları kayda değer bir direnç olmadan varsa, başarılı kireç kaldırmayı onaylayın. PBS'deki %4 formaldehit çözeltisinin on kat hacmindeki doku örneklerini bir gecede dört santigrat derecede kesin.
Ertesi gün, dokuyu suda çözünür bir gömme ortamına Kriyotome düğmesine yerleştirin, böylece eksenel bir düzlem veya kollajen tipini normal olarak kesen bir düzlem oluşturulur. Gömülü dokuyu insan örneklerinde 70 mikrometre ve sığır örneklerinde 40 mikrometre kalınlığında bölümlerek standart Kriyotom'ı kullanın. Bölümleri PBS ile üç kez durulamadan önce cam bir slayt üzerinde toplayın, uygun bir floresan boya ekleyin ve ardından montaj ortamını ekleyin ve bölümleri bir kapak kayması ile örtün.
Floresan mikroskopun örnek tutucusuna leke dokusu kesiti ile bir slayt yerleştirin, yapı aydınlatma cihazı floresan filtreler ve yeterli aydınlatma ile tek görüş alanı görüntüleme gerçekleştirin. Florescence mikroskobu ile uyumlu bir görüntü optimizasyonu yazılımı kullanarak, yoğunluğu ve parlaklığı optimize ederek resimleri işleyin. Bölümü bir bütün olarak görselleştirmek için, araç çubuğu panelinden 60 alım ayarını açarak ve mozaik kayıtlarında mozaik ayarlarını ayarlayarak mozaik görüntüleme tekniğini kullanın.
Bunu yapmak için, daha sonra tek bir genel bakış görüntüsünde birleştirilecek görünüm alanı görüntülerinin sütun ve satır sayısını tanımlamak için, kuruluma basın ve tek tek döşemelerin odak düzeltmesini ayarlayın. Yoğunluğu ve parlaklığı optimize ederek resimleri işleyin. Uzamsal kondrosit organizasyonunu analiz etmek için, Z eksenindeki başlangıç ve durdurma konumları ve dilim mesafesi gibi tarama parametrelerini tanımlayın.
Hücresel desenlerin nicel analizi için tek tek hücresel desenleri tanımlayın ve bir hücre sayısı eklentisi kullanın, sayılan hücreleri seçilen ilgi bölgesinin boyutuna bölerek hücre yoğunluğunu hesaplayın. Annulus ve daha yumuşak çekirdeklerdeki yoğun kollajen lif ağı ile IVD'nin mimarisi eksenel ve sagittal düzlemde çekilen mozaik görüntülerde tanınabilir. Mozaik görüntülerden büyütülmüş alanlarda, tek hücre, çiftler ve telliler gibi kondrositlerin farklı uzamsal organizasyon desenleri fark edildi.
Sığır annulus fibrozisinin farklı gelişim ve olgunlaşma evrelerinin incelenmesi embriyonik disk gelişimi sırasında hücresel yoğunlukta sürekli bir azalma gösterdi. Öte yandan, dejenerasyon sırasında yetişkin insan diskinde artan bir hücresel yoğunluk ve küme oluşumu gözlendi. Sığır annulus fibrozis ve sığır çekirdeği pulposusunda IVD gelişiminin erken evrelerindeki hücre yoğunluğu doğuma kadar hızla azaldı.
IvD'nin Epitome ile kanal görüntülemesi ile sitoplazma ve çekirdek gibi mekansal desenlerin 3D mimarisinin görselleştirilmesine izin verildi, sağlam IVD single'ında ve kondrosit çiftlerinde görüldü. Oysa dejenere olmuş anulus hücre kümeleri bulundu. En zor kısım, dokuyu kökenine tahsis etmek ve bölümleme için gömülü olanı düzeltmektir.
Güvenilir sonuçlar elde etmek için bu gereklidir. IVD dokuyu farklı aşamalardan ve kökenlerden doğru bir şekilde parçalara ayırıp seçmiş olmak, ELISA veya atomik kuvvet mikroskopisi gibi daha fazla biyokimyasal ve biyomekanik analiz yaparak analizi derinleştirmemizi sağlar.
