A degeneração do disco intervertebral leva a um alto grau de comprometimento e dor. Nosso protocolo nos permite investigar o desenvolvimento de discos morfologicamente e suas mudanças na degeneração. A densa rede tipo um de colágeno torna geralmente difícil analisar o Disco Intervertebral por microscopia.
Com a secção óptica, podemos investigar o arranjo 3D de condrócitos dentro dos diferentes tecidos. Comece colocando amostras de Disco Intervertebral ou IVD em DMEM complementadas com volume de 2%por volume Penicillin-Streptomycin, e 1,2% de volume por volume A anfotericina B, imediatamente pós-coleta, armazenar amostras de IVD a quatro graus Celsius até um processamento posterior. Se congelado descongelar as amostras de IVD humanos à temperatura ambiente e identificar a origem do tecido IVD humano com base em propriedades microscópicas como;densidade e orientação universitária.
Para coletar o tecido do disco bovino, pegue o segmento de movimento constituído pelo IVD com suas duas vértebras adjacentes e usando uma lâmina cirúrgica número 15, disseque todo o disco bovino do osso subcondral, gire o disco para alcançar as áreas centradas. Após identificar as diferentes áreas da cartilagem, use uma lâmina cirúrgica número 20 ou 22 para cortar a área de interesse de todo o disco. Os IVDs de embriões bovinos com comprimento de alcatra menor que 20 centímetros devem ser processados sem dissecção.
Realizou a decalcificação do tecido conforme descrito no manuscrito. Confirme a decalcificação bem sucedida, se uma agulha de calibre 20 penetrar no tecido do disco, ou se for aplicável as vértebras sem notável resistência. Exatamente as amostras de tecido no volume de dez vezes da solução de formaldeído de 4% na PBS durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, coloque o tecido em um meio de incorporação solúvel em água no botão Cryotome, de tal forma que um plano axial ou um plano que perpendicularmente corta o tipo de colágeno um normalmente é gerado. Use o Cryotome padrão para secionar o tecido incorporado a uma espessura de 70 micrômetros em amostras humanas e 40 micrômetros em amostras bovinas. Colete as seções em um slide de vidro antes de enxaguar as seções três vezes com PBS, adicione um corante fluorescente adequado seguido do meio de montagem e cubra as seções com um deslizamento de cobertura.
Coloque um slide com uma seção de tecido de manchas no porta-amostras do microscópio florescence, iniciando o dispositivo de iluminação da estrutura realizar uma única imagem de campo de visão com filtros fluorescentes e iluminação adequada. Usando um software de otimização de imagem compatível com o microscópio florescence, processe as imagens otimizando a intensidade e o brilho. Para visualizar a seção como um todo, utilize a técnica de imagem de mosaico, abrindo as 60 configurações de aquisição do painel da barra de ferramentas e ajustando as configurações do mosaico no registro de mosaicos.
Para isso, defina o número de colunas e linhas de imagens de campo de exibição que depois serão incorporadas em uma imagem de visão geral, pressione a configuração e ajuste a correção do foco das telhas individuais. Pós-processe as imagens otimizando a intensidade e o brilho. Para analisar a organização do condrocito espacial use a função 3d incorporada no software ajustando as configurações de pilha Z com o botão start/stop, defina os parâmetros de varredura como as posições de partida e parada no eixo Z e na distância da fatia.
Identificar padrões celulares individuais e usar um plugin de contagem celular para a análise quantitativa dos padrões celulares, calcular a densidade celular dividindo as células contadas pelo tamanho da região escolhida de interesse. A arquitetura do IVD com sua densa rede de fibra de colágeno no anômulo e o núcleo mais suave pode ser reconhecida nas imagens de mosaico tiradas no plano axial e sagital. Em áreas ampliadas a partir das imagens do mosaico, diferentes padrões organizacionais espaciais de condrócitos como;células individuais, pares e cordas foram notados.
O estudo de diferentes estágios de desenvolvimento e maturação da fibrose do anulô bovino apresentou uma diminuição contínua da densidade celular durante o desenvolvimento do disco embrionário. Por outro lado, observou-se uma densidade celular crescente e formação de aglomerados no disco humano adulto durante a degeneração. A densidade celular nos estágios iniciais do desenvolvimento do IVD na fibrose do anulô bovino e no núcleo bovino pulposo diminuiu rapidamente até o nascimento.
Por meio de imagens de canal do IVD com o Epítome permitiram a visualização da arquitetura 3D dos padrões espaciais como o citoplasma e o núcleo, no single IVD intacto, bem como pares de condrócitos foram avistados. Enquanto nos aglomerados de células ulus degenerados foram encontrados. A parte mais desafiadora é alocar o tecido à sua origem e corrigir o incorporado para secção.
Isso é essencial para obter resultados confiáveis. Ter corretamente dissecado e selecionado tecido IVD de diferentes estágios e origens nos permite aprofundar a análise por mais análises bioquímicas e biomecânicas, como a ELISA ou microscopia de força atômica.
