ניוון דיסק בין חולייתי מוביל במידה גבוהה של ליקוי וכאב. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לחקור התפתחות דיסק מורפולוגית ואת השינויים שלה בניוון. רשת קולגן צפופה מסוג אחד מקשה בדרך כלל לנתח את הדיסק הבין חולייתי על ידי מיקרוסקופיה.
עם חתך אופטי, אנחנו יכולים לחקור את הסידור 3D של chondrocytes בתוך הרקמות השונות. התחל על ידי הצבת תוך-אופרטיביות המתקבלות, דיסק בין חולייתי או דגימות IVD ב- DMEM בתוספת 2% נפח על ידי נפח פניצילין-סטרפטומיצין, ונפח של 1.2% על ידי נפח אמפוסטריצין B, מיד לאחר איסוף, לאחסן דגימות IVD בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. אם קפוא להפשיר את דגימות IVD האנושי בטמפרטורת החדר ולזהות את המקור של רקמת IVD האנושית המבוססת על תכונות מיקרוסקופיות כגון;צפיפות המכללה והתמצאות.
כדי לאסוף את רקמת דיסק בקר, לקחת את קטע התנועה המורכב IVD עם שתי החוליות הסמוכות שלה באמצעות להב כירורגי מספר 15, לנתח את כל דיסק בקר מן העצם התת-שכונתית, להפוך את הדיסק כדי להגיע לאזורים המרוכזים. לאחר זיהוי האזורים השונים של הסחוס, השתמש בלהב כירורגי מספר 20 או 22 כדי לחתוך את תחום העניין מהדיסק כולו. יש לעבד את ההVDs מעוברי בקר עם אורך ישבן כתר קטן מ-20 ס"מ ללא ניתוח.
ביצע הסתיידות של הרקמה כמתואר בכתב היד. אשר הסתיידות מוצלחת, אם מחט 20 מד חודרת לרקמת הדיסק, או אם ישים את החוליות ללא התנגדות בולטת. מדויק את דגימות הרקמה בנפח פי עשרה של תמיסת פורמלדהיד 4% ב- PBS לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, מניחים את הרקמה במדיום הטמעה מסיס במים על ידית הקריוטום, כך שמטוס צירי או מטוס שחותך בניצב את סוג הקולגן בדרך כלל נוצר. השתמש Cryotome הסטנדרטי כדי לחתך את הרקמה המוטבעת בעובי של 70 מיקרומטר בדגימות אנושיות ו 40 מיקרומטר בדגימות בקר. לאסוף את המקטעים על שקופית זכוכית לפני שטיפה של החלקים שלוש פעמים עם PBS, להוסיף צבע פלואורסצנטי מתאים ואחריו מדיום הרכבה לכסות את החלקים עם פתק כיסוי.
הנח שקופית עם מקטע רקמת כתם על מחזיק המדגם של מיקרוסקופ פלורסנט על ידי הפעלת התקן תאורת המבנה לבצע הדמיה שדה ראייה יחיד עם מסננים פלואורסצנטיים ותאורה נאותה. באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונות התואמת למיקרוסקופ Florescence, מעבד את התמונות על ידי אופטימיזציה של העוצמה והבהירות. כדי להמחיש את המקטע בכללותו, השתמש בטכניקת הדמיית הפסיפס על-ידי פתיחת 60 הגדרות הרכישה מלוח סרגל הכלים והתאמת הגדרות הפסיפס ברישום הפסיפסים.
כדי לעשות זאת הגדר את מספר העמודות והשורות של תמונות שדה תצוגה שמאוחר יותר ימוזגו לתמונת מבט כוללת אחת, הקש על הגדרה והתאם את תיקון המוקד של אריחים בודדים. לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות. כדי לנתח את הארגון מרחבי chondrocyte להשתמש בפונקציה 3D המשולבת בתוכנה על ידי התאמת הגדרות מחסנית Z עם לחצן התחלה / עצירה, להגדיר את הפרמטרים סריקה כמו מיקום התחלה ותחנה בציר Z ואת מרחק פרוסה.
זהה דפוסים תאיים בודדים והשתמש בתוסף ספירת תאים לניתוח הכמותי של התבניות התאיות, חשב את צפיפות התאים על-ידי חלוקת התאים שנספרו לפי גודל אזור העניין שנבחר. ניתן לזהות את הארכיטקטורה של ה- IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלו באנולוס ואת הגרעין הרך יותר בתמונות הפסיפס שצולמו במישור צירי וחרגי. באזורים מוגדלים מתמונות הפסיפס, הבחינו בדפוסים ארגוניים מרחביים שונים של כונדרוציטים כגון; תאים בודדים, זוגות ומיתרים.
המחקר של שלבי התפתחות והתבגרות שונים של פיברוזיס אנולוס בקר הראה ירידה מתמשכת בצפיפות התאים במהלך התפתחות דיסק עוברי. מצד שני, צפיפות תאית גוברת ויצירת אשכול נצפו בדיסק האנושי הבוגר במהלך ניוון. צפיפות התאים בשלבים המוקדמים של התפתחות ההורייה הVD בפיברוזיס של אנולוס בקר ובגרעין השבר pulposus ירדה במהירות עד הלידה.
על ידי הדמיית ערוץ של IVD עם Epitome מותר הדמיה של הארכיטקטורה 3D של דפוסים מרחביים כגון ציטופלסמה ו הגרעין, בסינגל IVD שלם, כמו גם זוגות של כונדרוציטים נצפו. בעוד באשכולות תאי אנולוס המנוונים נמצאו. החלק המאתגר ביותר הוא להקצות את הרקמה למקורה ולתקן את המוטמע לחתך.
זה חיוני כדי להשיג תוצאות אמינות. לאחר ניתוח נכון ונבחר רקמת IVD משלבים שונים ומקורות מאפשר לנו להעמיק את הניתוח על ידי ניתוח ביוכימי וביומכני נוסף, כגון ELISA או מיקרוסקופיה כוח אטומי.
