该协议允许成纤维细胞在定义的机械条件下构建和组织自己的环境。这些导致各向异性组织具有与细胞自然环境相当的刚度和基质组成。这种方法允许并行比较多达48个条件。
它在所用细胞类型和培养条件方面具有灵活性。通过仅使用几个明确定义的组件，它可以在实验室之间重复。通过应用促纤维化因子或抗纤维化药物，该协议可用于研究任何类型的纤维化疾病的潜在过程和治疗方法。
演示该程序的将是我们实验室的博士生Alisa Degrave和我自己。首先，在37摄氏度的水浴中解冻保存的心脏成纤维细胞约两分钟，直到小瓶只剩下少量冰。接下来，使用两毫升血清学移液管将细胞悬浮液滴转移到含有10毫升成纤维细胞生长培养基的适当无菌离心管中。
为了获得最佳的细胞检索，用一毫升FGM冲洗冷冻小瓶并将其转移到离心管中。轻轻重悬细胞并转移到细胞培养瓶中。每隔一天补充一次女性生殖器切割，持续五天或直到细胞达到80%汇合度。
从培养的细胞中吸取培养基后，用六毫升PBS洗涤细胞并吸出，然后将六毫升细胞解离试剂加入细胞并孵育直到细胞分离可见。通过向细胞关联试剂中移出的细胞中添加6至12毫升FGM来中和酶活性。使用10毫升血清学移液器轻轻地上下移液四到八次，以确保单细胞悬浮液，并将细胞转移到新鲜的50毫升收集管中。
根据制造商的说明，在自动细胞计数器的帮助下验证产量，并将细胞沉淀下来。离心后，吸出上清液，轻拂管以移走沉淀并在FGM中重悬细胞。接下来，通过40微米目细胞过滤器过滤细胞悬浮液，然后使用自动细胞计数器，通过电流排除评估细胞数量和活力，以确保可靠的细胞数量，然后再进行工程结缔组织或ECT制备。
为了准备ECT，通过添加FGM将细胞悬浮液调整到20至25摄氏度的每毫升890万个细胞，并将细胞保持在冰上。将含有ECT水凝胶混合物单个组分的所有其他管转移到冰上，并预冷空的50毫升离心管以制备混合物。通过将文本中描述的组分添加到预冷的50毫升离心管中来开始制备ECT水凝胶混合物，以避免气泡形成。
首先，将酸溶性I型胶原蛋白水凝胶移液到具有宽孔径尖端的血清学移液器中。通过添加DMEM来调整胶原蛋白溶液的盐含量，同时轻轻旋转管以进行适当混合。为了中和pH值，在旋转管时加入0.2摩尔氢氧化钠，并通过观察酚红指示剂的红色来确认中和。
然后滴加细胞悬浮液，同时轻轻旋转管子。使用具有宽孔口的血清学移液器轻轻地上下管道一次，以混合悬浮液，以避免气泡形成并最大限度地减少剪切应力。轻轻旋转管子10次，以便彻底混合。
在整个铸造过程中，将含有ECT水凝胶混合物的离心管保持在冰上。在ECT水凝胶混合物中润湿一毫升移液器尖端，然后将180微升水凝胶混合物均匀地分配到48孔浇注板的每个模具中，避免可能影响胶原基质组件完整性的过度剪切力，并确保整个板在15至20分钟内完成。确保在模具内形成完整的环路，因为ECT混合物的不连续分布将防止完整的ECT环形成。
避免在移液过程中移液到内孔并形成气泡，以确保均匀的ECT水凝胶浇注，从而形成均匀和功能性的组织。小心地将48孔浇注板放入细胞培养箱内，以重建ECT水凝胶混合物15至30分钟。孵育后，它看起来像凝胶状和不透明。
沿着墙壁每孔轻轻添加600微升37摄氏度的温热FGM，以避免ECT从底部脱落。每天用500微升女性生殖器切割代替培养基，直到分析。在所需的时间点，使用体视显微镜记录ECT的顶部和侧面视图的显微图像。
使用图像处理程序执行线阵扫描分析。设置刻度并使用直线工具在每个成像平面中每个臂至少六个位置跟踪和测量ECT直径。在记录设备下对48孔铸造板进行成像，该记录设备具有放置在固定距离的集成面阵扫描相机，并配有高分辨率单色图像传感器和近紫外光源。
自动检测含有荧光染料的两极尖端，以最大限度地提高对比度。通过在软件上运行记录的图像来自动分析，以检测黑暗背景或图像处理程序上的高对比度明亮像素，从而使用自动分析来测量每日记录中的极点之间的距离。从固定杆上取下 ECT，然后插入转接钩和 ECT 环。
然后将ECT转移到两个钩子上，夹在固定臂和扩展动态机械仪器的传感器臂上，该机械臂配备了充满PBS的37摄氏度回火风琴浴。通过将 Riometer 设置为每秒钩子之间初始距离的大约 1%，以恒定的线性速率施加单轴张力。0.03毫米/秒的恒定拉伸速率可用于典型的ECT尺寸。
撕裂换能器的力并启动拉伸。通过横截面积归一化测得的力并绘制确定不同生物力学参数的应力 - 应变曲线后，继续记录直到ECT断裂点。就在组织开始微断裂之前，弹性区域的上限对应于屈服点，其应变是组织弹性的量度。
塑性区域位于屈服点和失效点之间。失效点对应于由于组织破裂而导致的应力突然下降，定义了最终应变，这是组织延伸性的量度。第三个测量点对应于由组织在拉伸过程中可以承受而不会断裂的最高应力定义的最大强度。
曲线下面积给出的弹性和韧性分别对应于组织吸收的能量，直至屈服点和失效点。对于每条得到的曲线，弹性区域线性部分的斜率对应于杨氏模量，也称为弹性模量。它是一种测量组织刚度的机械性能。
使用该协议，在控制条件下和存在FCS的情况下，ECT压实和收缩在铸造后几个小时内进行，并且明显增加至第五天。当用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A处理ECT时，ECT压实度降低，如与对照组相比，横截面积显着增加。在五天的培养过程中评估组织的收缩。
在没有Latrunculin A的情况下，收缩逐渐增加，直到第五天达到约40%的收缩。然而，Latrunculin A的存在影响了组织的收缩，导致只有约20%的最大收缩。肌动蛋白聚合抑制导致对照组织僵硬度显著降低约50%。
这些结果表明，肌动蛋白细胞骨架完整性对于ECT压实，收缩和变硬至关重要。重要的是要选择可靠，高质量的胶原蛋白溶液，并确保使用具有高活力的单细胞悬浮液来重建工程结缔组织。
