Questo protocollo consente ai fibroblasti di costruire e organizzare il proprio ambiente in condizioni meccaniche definite. Questi risultati in tessuti anisotropi con rigidità e composizioni matriciali paragonabili all'ambiente naturale della cellula. Questo metodo consente di confrontare fino a 48 condizioni in parallelo.
È flessibile rispetto al tipo di cellula utilizzato e alle condizioni di coltura. Utilizzando solo pochi componenti ben definiti, è riproducibile tra i laboratori. Applicando fattori pro-fibrotici o farmaci antifibrotici, questo protocollo può essere utilizzato per studiare i processi e le terapie sottostanti delle malattie fibrotiche di qualsiasi tipo.
A dimostrare la procedura saranno Alisa Degrave, dottoranda del nostro laboratorio, e io. Per cominciare, scongelare i fibroblasti cardiaci crio-conservati a bagnomaria a 37 gradi Celsius per circa due minuti fino a quando la fiala non rimane con solo una piccola quantità di ghiaccio. Quindi, trasferire la sospensione cellulare a goccia usando una pipetta sierologica da due millilitri in un tubo centrifugo sterile appropriato contenente 10 millilitri di terreno di crescita dei fibroblasti.
Per un recupero ottimale delle cellule, sciacquare la crio-fiala con un millilitro di MGF e trasferirla nel tubo della centrifuga. Risospese delicatamente le cellule e trasferirle in un pallone di coltura cellulare. Reintegrare le MGF a giorni alterni per cinque giorni o fino a quando le cellule non hanno raggiunto l'80% di confluenza.
Dopo aver aspirato il mezzo dalle cellule coltivate, lavare le cellule con sei millilitri di PBS e aspirare, quindi aggiungere sei millilitri del reagente di dissociazione cellulare alle cellule e incubare fino a quando il distacco cellulare è visibile. Neutralizzare l'attività enzimatica aggiungendo da sei a 12 millilitri di MGF alle cellule spostate nel reagente di associazione cellulare. Pipettare delicatamente su e giù da quattro a otto volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri per garantire una sospensione a cella singola e trasferire le celle in un tubo di raccolta fresco da 50 millilitri.
Verificare la resa con l'aiuto di un contatore di celle automatizzato secondo le istruzioni del produttore e pellet giù per le celle. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante, far scorrere il tubo per rimuovere il pellet e risospesso le cellule nelle MGF. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare a maglie da 40 micrometri, quindi utilizzare un contatore cellulare automatizzato, valutare il numero di cellule e la vitalità mediante esclusione di corrente elettrica per garantire numeri di cellule affidabili prima di procedere con tessuti connettivi ingegnerizzati o preparazione ECT.
Per prepararsi all'ECT, regolare la sospensione cellulare a 8,9 milioni di cellule per millilitro a 20-25 gradi Celsius aggiungendo MGF e mantenendo le cellule sul ghiaccio. Trasferire tutti gli altri tubi contenenti i singoli componenti della miscela di idrogel ECT sul ghiaccio e pre-raffreddare un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri per preparare la miscela. Iniziare a preparare la miscela di idrogel ECT aggiungendo i componenti descritti nel testo al tubo centrifugo pre-refrigerato da 50 millilitri evitando la formazione di bolle d'aria.
In primo luogo, pipettare l'idrogel di collagene solubile acido di tipo I in una pipetta sierologica con una punta di foro largo. Regolare il contenuto di sale della soluzione di collagene aggiungendo il DMEM mentre ruota delicatamente il tubo per una corretta miscelazione. Per neutralizzare il pH, aggiungere 0,2 idrossido di sodio molare mentre si ruota il tubo e confermare la neutralizzazione osservando il colore rosso dell'indicatore rosso fenolo.
Quindi aggiungere la sospensione cellulare a goccia mentre ruota delicatamente il tubo. Mescolare la sospensione convogliando delicatamente su e giù una sola volta utilizzando una pipetta sierologica con una punta a foro largo per evitare la formazione di bolle e ridurre al minimo lo sforzo di taglio. Ruotare delicatamente il tubo 10 volte per una miscelazione accurata.
Mantenere il tubo della centrifuga contenente miscela di idrogel ECT su ghiaccio durante tutto il processo di fusione. Bagnare una punta di pipetta da un millilitro in miscela di idrogel ECT, quindi distribuire 180 microlitri di miscela di idrogel in modo uniforme in ogni stampo della piastra di colata a 48 pozzetti evitando eccessive forze di taglio che potrebbero influire sull'integrità dell'assemblaggio della matrice di collagene e assicurando che l'intera piastra finisca in 15-20 minuti. Assicurarsi che un anello completo si formi all'interno dello stampo poiché la distribuzione discontinua della miscela ECT impedirà la formazione di un anello ECT completo.
Evitare il pipettaggio nel pozzo interno e la formazione di bolle durante il pipettaggio per garantire una colata uniforme di idrogel ECT per una formazione di tessuto omogenea e funzionale. Posizionare con attenzione la piastra di colata a 48 pozzetti all'interno dell'incubatore di colture cellulari per ricostituire la miscela di idrogel ECT per 15-30 minuti. Dopo l'incubazione, appare gelatinoso e opaco.
Aggiungere 600 microlitri di 37 gradi Celsius di MGF caldo per pozzetto lungo la parete delicatamente per evitare il distacco dell'ECT dal fondo. Sostituire il mezzo ogni giorno con 500 microlitri di MGF fino all'analisi. Nei punti temporali desiderati, utilizzare uno stereomicroscopio per registrare immagini microscopiche delle viste superiori e laterali dell'ECT.
Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per eseguire un'analisi di scansione della linea. Impostare una scala e utilizzare lo strumento linea retta per tracciare e misurare i diametri ECT in un minimo di sei posizioni per braccio in ciascun piano di imaging. Immagine della piastra di fusione a 48 pozzetti sotto un dispositivo di registrazione con una telecamera di scansione dell'area integrata posizionata a una distanza fissa dotata di un sensore di immagine monocromatico ad alta risoluzione e di una sorgente di luce quasi UV.
Eseguire il rilevamento automatico delle punte dei poli contenenti colorante fluorescente per massimizzare il contrasto. Misura la distanza tra i poli dai record giornalieri utilizzando un'analisi automatizzata eseguendo le immagini registrate sul software per rilevare pixel luminosi ad alto contrasto su uno sfondo scuro o un programma di elaborazione delle immagini. Rimuovere l'ECT dai pali di ritenzione e inserire un gancio di trasferimento e un anello ECT.
Quindi trasferire l'ECT su due ganci bloccati al braccio stazionario e al braccio trasduttore di un riometro meccanico dinamico estensivo dotato di un bagno d'organo temperato a 37 gradi Celsius riempito con PBS. Applicare la tensione uniassiale a una velocità lineare costante impostando il riometro a circa l'1% della distanza iniziale tra i ganci al secondo. Una velocità di allungamento costante di 0,03 millimetri al secondo può essere utilizzata con dimensioni ECT tipiche.
Strappare la forza del trasduttore e avviare l'allungamento. Continuare a registrare fino al punto di rottura dell'ECT dopo aver normalizzato la forza misurata per area della sezione trasversale e tracciare la curva stress-deformazione determinando diversi parametri biomeccanici. Poco prima che il tessuto inizi la microfreturazione, il limite superiore della regione elastica corrisponde al punto di snervamento e la sua deformazione è una misura dell'elasticità del tessuto.
La regione di plastica si trova tra il punto di snervamento e il punto di guasto. Il punto di guasto corrisponde ad un improvviso calo dello stress dovuto alla rottura del tessuto, definendo la deformazione finale che è una misura dell'estensibilità tissutale. Il terzo punto di misura corrisponde alla massima resistenza definita dalla massima sollecitazione che il tessuto può sopportare senza rompersi durante l'allungamento.
La resilienza e la tenacità date dall'area sotto la curva corrisponde all'energia assorbita dal tessuto fino al punto di snervamento e al punto di guasto rispettivamente. Per ogni curva ottenuta, la pendenza della parte lineare della regione elastica corrisponde al modulo di Young, noto anche come modulo elastico. È una proprietà meccanica che misura la rigidità del tessuto.
Utilizzando questo protocollo, la compattazione e la contrazione ECT in condizioni di controllo e in presenza di FCS sono seguite poche ore dopo la fusione e in particolare sono aumentate fino al quinto giorno. Quando l'ECT è stato trattato con l'inibitore della polimerizzazione dell'actina Latrunculin A, la compattazione dell'ECT è stata ridotta come indicato dall'area della sezione trasversale significativamente più alta rispetto al controllo. La contrazione dei tessuti è stata valutata durante i cinque giorni di coltura.
In assenza di Latrunculin A, la contrazione è aumentata gradualmente fino al quinto giorno raggiungendo una contrazione di circa il 40%. Tuttavia, la presenza di Latrunculin A ha influenzato la contrazione tissutale con conseguente contrazione massima di circa il 20%. L'inibizione della polimerizzazione dell'actina ha portato a una significativa riduzione di circa il 50% della rigidità del tessuto rispetto al controllo.
Questi risultati dimostrano che l'integrità citoscheletrica dell'actina è essenziale per la compattazione, la contrazione e l'irrigidimento dell'ECT. È importante selezionare una soluzione di collagene affidabile e di alta qualità e assicurarsi che una sospensione unicellulare ad alta vitalità venga utilizzata per ricostituire i tessuti connettivi ingegnerizzati.
