Bu protokol, fibroblast'ın tanımlanmış mekanik koşullar altında kendi ortamlarını inşa etmelerini ve düzenlemelerini sağlar. Bunlar, hücrenin doğal ortamıyla karşılaştırılabilir sertlik ve matris bileşimlerine sahip anizotropik dokularla sonuçlanır. Bu yöntem, paralel olarak 48'e kadar koşulu karşılaştırmaya izin verir.
Kullanılan hücre tipi ve kültür koşullarına göre esnektir. Sadece birkaç iyi tanımlanmış bileşen kullanılarak laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir. Pro-fibrotik faktörler veya antifibrotik ilaçlar uygulanarak, bu protokol her türlü fibrotik hastalıkların alttaki süreçlerini ve tedavilerini incelemek için kullanılabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Alisa Degrave ve ben olacağım. Başlangıç olarak, kriyo ile korunmuş kardiyak fibroblastları 37 santigrat derecede bir su banyosunda, şişe sadece az miktarda buzla kalana kadar yaklaşık iki dakika çözün. Daha sonra, hücre süspansiyonunun iki mililitre serolojik pipet kullanarak damla yönünde 10 mililitre fibroblast büyüme ortamı içeren uygun bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
En uygun hücre alımı için kriyo şişesini bir mililitre FGM ile durulayın ve santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri yavaşça yeniden biriktirin ve bir hücre kültürü şişesine aktarın. FGM'i beş gün boyunca veya hücreler% 80 izdiah edene kadar her gün yenile.
Ortamı kültürlü hücrelerden aldıktan sonra, hücreleri altı mililitre PBS ile yıkayın ve aspirat edin, ardından hücrelere altı mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve hücre müfrezesi görünene kadar kuluçkaya yatırın. Hücre ilişkisi reaktifinde yerinden çıkan hücrelere altı ila 12 mililitre FGM ekleyerek enzymatic aktiviteyi nötralize edin. Tek hücreli süspansiyon sağlamak ve hücreleri taze bir 50 mililitre toplama tüpüne aktarmak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak dört ila sekiz kez yavaşça pipet.
Üreticinin talimatlarına göre otomatik bir hücre sayacı yardımıyla verimi doğrulayın ve hücreleri aşağı doğrulayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin, peletin yerinden çıkarmak ve FGM'deki hücreleri yeniden canlandırmak için tüpü hareket ettirİn. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 40 mikrometre örgü hücre süzgecinden geçirin, ardından otomatik bir hücre sayacı kullanarak, tasarlanmış bağ dokuları veya EKT hazırlığına devam etmeden önce güvenilir hücre numaraları sağlamak için hücre sayısını ve canlılığı elektrik akımı dışlama ile değerlendirin.
EKT'ye hazırlanmak için, hücre süspansiyonu FGM ekleyerek mililitre başına 20 ila 25 santigrat derecede 8,9 milyon hücreye ayarlayın ve hücreleri buzda tutun. ECT hidrojel karışımının bireysel bileşenlerini içeren diğer tüm tüpleri buza aktarın ve karışımı hazırlamak için boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü önceden soğutun. Hava kabarcığı oluşumunu önleyen önceden soğutulmuş 50 mililitre santrifüj tüpüne metinde açıklanan bileşenleri ekleyerek ECT hidrojel karışımını hazırlamaya başlayın.
İlk olarak, pipet asit çözünür kollajen tipi I hidrojel geniş bir delik ucu ile serolojik bir pipet içine. Uygun karıştırma için tüpü hafifçe döndürürken DMEM'i ekleyerek kollajen çözeltisinin tuz içeriğini ayarlayın. pH'ı nötralize etmek için, tüpü döndürürken 0,2 molar sodyum hidroksit ekleyin ve fenol kırmızı göstergesinin kırmızı rengini gözlemleyerek nötralizasyonunu onaylayın.
Daha sonra tüpü hafifçe döndürürken hücre süspansiyonu damla yönünde ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek ve kesme stresini en aza indirmek için geniş delikli bir uçlu serolojik pipet kullanarak süspansiyonu sadece bir kez hafifçe yukarı ve aşağı borula karıştırın. Kapsamlı karıştırma için tüpü 10 kez hafifçe döndürün.
ECT hidrojel karışımı içeren santrifüj tüpünü döküm işlemi boyunca buz üzerinde tutun. ECT hidrojel karışımında bir mililitre pipet ucu ıslatın, ardından 48 kuyulu döküm plakasının her kalıbına eşit olarak 180 mikrolitre hidrojel karışımı dağıtın, kollajen matris tertibatının bütünlüğünü etkileyebilecek aşırı kesme kuvvetlerini önleyin ve tüm plakanın 15 ila 20 dakika içinde bitmesini sağlayın. ECT karışımının süreksiz dağılımı tam bir ECT halkası oluşumunu önleyeceğinden, kalıp içinde tam bir döngü oluşmasını sağlayın.
Homojen ve fonksiyonel doku oluşumu için düzgün bir ECT hidrojel dökümü sağlamak için iç kuyuya pipetlemekten ve pipetleme sırasında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. ECT hidrojel karışımını 15 ila 30 dakika yeniden inşa etmek için 48 kuyulu döküm plakasını hücre kültürü inkübatörünün içine dikkatlice yerleştirin. Kuluçkadan sonra jel benzeri ve opak görünür.
AİHM'nin alttan kopmasını önlemek için duvar boyunca yavaşça duvar boyunca 37 santigrat derecelik 600 mikrolitre sıcak FGM ekleyin. Analize kadar ortamı her gün 500 mikrolitre FGM ile değiştirin. İstenilen zaman noktalarında, AİHM'nin üst ve yan görünümlerinin mikroskobik görüntülerini kaydetmek için bir stereo mikroskop kullanın.
Hat tarama çözümlemesi gerçekleştirmek için görüntü işleme programı kullanın. Bir ölçek ayarlayın ve her görüntüleme düzleminde kol başına en az altı konumdaKI EKT çaplarını izlemek ve ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Yüksek çözünürlüklü tek renkli görüntü sensörü ve UV'ye yakın ışık kaynağı ile donatılmış sabit bir mesafeye yerleştirilmiş entegre alan tarama kamerasına sahip bir kayıt cihazının altındaki 48 kuyu döküm plakasını görüntüleyin.
Kontrastı en üst düzeye çıkarmak için floresan boya içeren kutup uçlarının otomatik algılamasını gerçekleştirin. Karanlık bir arka plan veya görüntü işleme programında yüksek kontrastlı parlak pikselleri algılamak için kaydedilen görüntüleri yazılımda çalıştırarak otomatik bir analiz kullanarak kutuplar arasındaki günlük kayıtlardan uzaklığı ölçün. ECT'yi tutma direklerinden çıkarın ve bir aktarma kancası ve EKT döngüsü takın.
Daha sonra ECT'yi sabit kola ve PBS ile dolu 37 santigrat derece temperli organ banyosu ile donatılmış uzatmalı dinamik mekanik riometrenin dönüştürücü koluna kenetlenmiş iki kancaya aktarın. Riometreyi kancalar arasındaki başlangıç mesafesinin yaklaşık %1'ine ayarlayarak sabit doğrusal hızda tek eksenli gerilim uygulayın. Tipik EKT boyutlarıyla saniyede 0,03 milimetre sabit bir esneme hızı kullanılabilir.
Dönüştürücünün kuvvetini yırtın ve esnemeyi başlatın. Ölçülen kuvveti kesitsel alanla normalleştirdikten sonra EKT yırtılma noktasına kadar kayıt yapmaya devam edin ve farklı biyomekanik parametreleri belirleyen stres-gerinim eğrisini çizin. Doku mikro kırılmaya başlamadan hemen önce, elastik bölgenin üst sınırı verim noktasına karşılık gelir ve suşu doku elastikiyetinin bir ölçüsüdür.
Plastik bölge verim noktası ile arıza noktası arasındadır. Başarısızlık noktası, dokunun yırtılmasına bağlı streste ani bir düşüşe karşılık gelir ve doku genişletilebilirliğinin bir ölçüsü olan nihai suşu tanımlar. Üçüncü ölçüm noktası, dokunun esneme sırasında kırılmadan taşıyabileceği en yüksek stresle tanımlanan maksimum güce karşılık gelir.
Eğrinin altındaki alanın verdiği esneklik ve tokluk, doku tarafından emilen enerjiye sırasıyla verim noktasına ve başarısızlık noktasına kadar karşılık gelir. Elde edilen her eğri için, elastik bölgenin doğrusal kısmının eğimi, Young'un elastik modül olarak da bilinen modülüne karşılık gelir. Dokunun sertliğini ölçen mekanik bir özelliktir.
Bu protokol kullanılarak, kontrol koşulları altında ve FCS varlığında ECT sıkıştırma ve daralma dökümden birkaç saat sonra ortaya çıktı ve özellikle beşinci güne kadar arttı. ECT, aktin polimerizasyon inhibitörü Latrunculin A ile tedavi edildiğinde, ECT sıkıştırması kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek kesit alanı tarafından belirtildiği gibi azaltıldı. Dokuların kasılması beş günlük kültür boyunca değerlendirildi.
Latrunculin A'nın yokluğunda, kasılma yavaş yavaş beşinci güne kadar artarak yaklaşık% 40 daralmaya ulaştı. Bununla birlikte, Latrunculin Bir varlığı doku kasılmasını etkiledi ve sadece% 20 maksimum kasılma ile sonuçlandı. Aksin polimerizasyon inhibisyonu, kontrol üzerindeki doku sertliğinde yaklaşık% 50'lik önemli bir azalmaya yol açtı.
Bu sonuçlar, aktin sitoskeletal bütünlüğünün ECT sıkıştırma, kasılma ve sertleşme için gerekli olduğunu göstermektedir. Güvenilir, yüksek kaliteli bir kolajen çözeltisi seçmek ve mühendislik konvektif dokuları yeniden inşa etmek için yüksek canlılığa sahip tek hücreli bir süspansiyon kullanılmasını sağlamak önemlidir.
