检测蛋白质低洼构象状态的高压NMR实验

高压是改变蛋白质构象样品相对量的选择方法。它对于隔离和描述高能构象状态非常有用。与所有扰动方法（如 pH 值或温度）相比，压力扰动易于应用且完全可逆。

它也是局部扰动，主要影响玻璃腔或空量区域。首先，使用玻璃移液器将氮-15标签样品引入氧化锌管，并确保样品位于管底。为了防止样品与透水液混合，将样品与 200 微升矿物油覆盖，然后用透气液填充管子的其余部分。

将一次性 O 环放在氧化锌管顶部，将管子滑入底座。然后将管子连接到高压系绳线，然后用手将底座拧紧到细胞上。然后应用 14.7 牛顿米扭矩，以防止在较低压力下泄漏。

为了检查压力电池组件的完整性，使用电池支撑和密封容器对光谱仪外的管子加压至多 300 条。15 分钟后，将压力重置到一个栏，并使用干净的无绒毛擦拭检查泄漏情况。通过仔细引导系绳线，将未加压管插入光谱仪。

将管子滑入光谱仪，直到管子达到样品坐姿。锁定，闪烁，匹配和调整的钚和氮通道，并保存优化的 shims 为未来。使用异质单量子相干光谱设置横向放松优化光谱，并在大气条件下进行记录参考实验。

每 500 条记录一系列 2D 实验，从一个栏到 2.5 千巴。如果已知精确的折叠或展开速率，在每 500 条增量后，让样品均等化 15 到 20 分钟。当折叠或展开过渡的拐点到达时，记录额外的实验以提高拟合精度。

该协议用于探讨RRM2的压力依赖性，RRM2是第二个RNA识别主题异质核核核蛋白A1。横向放松优化光谱与异质单量子相干光谱收集在一个酒吧，1.5千巴，两千巴和2.5千巴。RRM2 几乎完全展开在 2.5 千巴范围内。根据此处显示的方程安装单个压力强度配置文件，以获得与展开反应相关的标准 Gibbs 自由能量和体积的相应变化。

在域结构上映射时，在域结构核心中发现了体积变化幅度最大的残留物，而体积变化幅度最小的残留物主要位于β链和β链与C终端氦的连接环中。为了探究折叠状态合奏的可压缩性和构象异质性，分析了蛋白化学移位。使用所示方程（提取特定地点的线性系数和非线性系数）来安装作为压力函数的蛋白化学移位的个别配置文件。

非线性系数最大的残留物大多位于域的结构核心中，而非线性系数最小的残留物大多位于连接不同结构主题的环中。正确设置管子作为压力设置非常重要，以防止泄漏。如果发生泄漏，探测器可能需要拆除，以清理矿物油的任何痕迹。