¹⁵N CPMG 放松分散，用于研究 μs-ms 时间尺度上的蛋白质符合性动力学

此协议可用于蛋白质构象动力学的检测和定性，这对理解各种细胞过程至关重要。与其他方法相比，该方法不需要专门的样品制备步骤，并提供了动力学、热力学和确认平衡结构方面的综合特征。CPMG放松分散可以更广泛地应用于核酸和其他生物分子中确认动力学的特征，以及配体纳米粒子相互作用的特征。

我们的协议针对的是首次使用CPMG的用户。因此，这是一个很好的起点。但是，我们确实希望用户知道运行常规 NMR 实验的基本步骤。

要首次设置 NMR 实验，请先下载并解压这些补充文件。复制位。vv和trosy_15N_CPMG。

脉冲程序文件夹中的vv文件到脉冲程序目录。打开采集软件，使用 EDC 命令将以前运行的氢氮 15 HSQC 实验复制到新的实验中。使用脉冲程序命令加载trosy_15N_CPMG。

vv脉冲程序文件进入新创建的实验。然后使用脉冲程序文件末尾的说明来设置 CPMG 实验。要设置常规 NMR 实验，将样品引入磁铁，并执行所有基本的 NMR 采集步骤。

设置P1到氢硬90度脉冲的持续时间，P7设置为持续时间氮15硬90度脉冲。在采集窗口中，为氢气和氮气设置中心和光谱宽度 15 维。将放松延迟设置为 0.7 T2，并使用 VC 列表命令创建与 N 对应的整数列表。

将 L8 设置为 VC 列表中的条目数量，将 L3 设置为间接维度的实际点数，将 1TD 到 L8 次 L3 设置为 2 倍。为了优化水抑制，将接收器增益设置为一个，并键入 EDC 拉开脉冲程序文件。在 91 行中，删除 goto 999 之前的半冒号，并保存文件。

使用GS命令，调整SPDB0参数，以最大限度地降低FID信号的强度。修改信号强度后，在脉冲程序文件的第 91 行重新引入半冒号并保存文件。要优化 SPDB11，请将接收器增益设置为一个，并键入 EDC 拉动以打开脉冲程序文件。

在 168 行中，删除 goto 999 之前的半冒号，并保存文件。使用GS命令，调整SPDB11参数，以最大限度地降低FID信号的强度。修改信号强度后，在 168 行重新引入半冒号并保存文件。

要优化 SPDB2，将接收器增益设置为 1，然后输入 EDC 拉开脉冲程序文件。在 179 行上，删除 goto 999 之前的半冒号，并保存文件。使用GS命令，调整SPDB2参数，以最大限度地降低FID信号的强度。

修改信号强度后，在脉冲程序文件的第 179 行重新引入半冒号并保存文件。要优化 PLDB2，请将接收器增益设置为 1，然后输入 EDC 拉开脉冲程序文件。在 184 行上，删除 goto 999 之前的半冒号，并保存文件。

使用GS命令，调整PLDB2参数，以最大限度地降低FID信号的强度。修改信号强度后，在脉冲程序文件的第 184 行重新引入半冒号并保存文件。运行 RGA 命令以优化接收器增益。

然后运行 ZG 命令以启动实验。在这个数字中，可以观察到氢氮15 Trosy光谱中每个峰值获得的放松分散剖面的结果。从获得的放松分散配置文件，可以估计交换贡献的氮15横向放松的每个骨干AMI组。

通过绘制被调查的蛋白质3D结构的横向松弛图，可以识别在微秒毫秒时间尺度上进行确认交换的结构区域。使用卡弗-里查德方程对放松分散曲线进行建模，返回交换过程中的热力学和动能参数，例如处于均衡状态的状态的分数种群和这些状态之间的汇率。然后，可以分别使用面包车霍夫方程和I环方程来模拟这些热力学和动能参数的温度依赖性，以获得关于确认交换能量的详细信息。

必须仔细优化所有收购参数，特别是P7。生产高度纯净和均质的样品也很重要，以避免虚假的分散。使用本协议获得的动能、热力学和化学芯片参数可用于获取有关进行确认交换的物种的能量和结构信息。CPMG方法获得的蛋白质确认动力学特征为理解信号和酶活性提供了重要信息，并为药物设计提供了新的视角。