高圧は、タンパク質立体構造サンプルの相対集団を変化させる方法です。高エネルギーの立体構造状態を特定し、特徴付けるための非常に有用です。pHや温度などのすべての摂動方法と比較すると、圧力摂動は適用しやすく、完全に可逆的です。
また、主にガラスの空洞や空隙体積を有する領域に影響を与える局所的な摂動である。まず、ガラスピペットを使用してジルコニアチューブに窒素15標識サンプルを導入し、チューブの底部のサンプルシートを確認します。サンプルが透過液と混合するのを防ぐには、サンプルを200マイクロリットルの鉱物油で重ね、残りのチューブに透過液を充填します。
ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、ベースにチューブをスライドさせます。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、手でセルにベースを締めます。次に、14.7ニュートンメートルのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます。
圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300本のバーを加圧します。15分後、圧力を1つのバーにリセットし、きれいな糸くずのない拭き取りで漏れをチェックします。テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。
チューブがサンプルの座っている位置に到達するまで、管を分光計に差し込む。プロチウムと窒素チャネルをロック、シム、マッチング、チューニングし、最適化されたシムを将来のために保存します。横方向緩和最適化分光法をヘテロ単一量子コヒーレント分光法で設定し、大気条件での基準実験の記録を進めます。
500本ごとに1つのバーから2.5キロバーまでの一連の2D実験を記録します。正確な折りたたみ速度または展開率がわかっている場合は、500 本のバーの増分を行った後、サンプルを 15 ~ 20 分間平衡させます。折り畳みまたは展開遷移の変曲点が到達したら、フィットの精度を向上させるために追加の実験を記録します。
このプロトコルは、RRM2の圧力依存性をプローブするために使用された、第2のRNA認識モチーフ不均一核リボヌクレオプロテインA1。横方向緩和最適化分光法ヘテロ単一量子コヒーレンス分光スペクトルを用いて、1つの棒、1.5キロバー、2キロバー、および2.5キロバーで収集した。RRM2は2.5キロバーの範囲内でほぼ完全に展開される。個々の圧力強度プロファイルは、ここで示す式に従って適合し、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギーおよび体積の対応する変化を得た。
ドメイン構造にマッピングすると、体積変化の大きさが最も大きい残基がドメイン構造コア内で見つかり、体積変化の最も大きさが小さいものは、主にベータ鎖とC端子ヘリクスとの間の接続ループに位置していた。折り畳まれた状態アンサンブルの圧縮性および立体構造の不均一性の程度を調査するために、プロチウム化学シフトを分析した。圧力の関数としてのプロチウム化学シフトの個々のプロファイルは、示された式を用いて適合し、部位特異的線形および非線形係数を抽出した。
非線形係数が最も大きい残基は主にドメインの構造コアに見られ、非線形係数が最も小さい残基は、異なる構造モチーフを結ぶループ内に位置していました。漏れを防ぐために、管を正しく設定する圧力として設定することが重要です。漏れが発生した場合、おそらく鉱物油の痕跡をクリーンアップするためにプローブを取り外す必要があります。
