毛细管电泳电喷雾电离质谱法绝对定量肌醇焦磷酸盐

这为我们迄今为止测试的所有生物体中的肌醇磷酸盐代谢提供了高质量的结果.它还将提供对我们目前所知的新细胞生物合成途径的见解。通过CE-ESI-MS分析肌醇磷酸代谢更快，灵敏度高，并且能够为肌醇磷酸组件提供结构信息。

首先，设置毛细管电泳电喷雾电离质谱或 CE-ESI-MS 系统，该系统由商用 CE 系统和配备安捷伦喷射流 ESI 源的三重四极杆串联质谱仪组成。接下来，连接鞘流1：100分流器和等度液相色谱泵出口，并确保CE系统入口小瓶与质量分析仪的喷雾器尖端处于同一高度。然后，利用MassHunter工作站版本或类似的MS软件，来控制整个系统以及数据采集和分析。

准备好CE电泳缓冲液和鞘液后，以每分钟5毫升的速度吹扫5分钟来安装护套液。然后将流速设置为每分钟一毫升，将泵压力设置为 180 bar。确保回收的管子连接回护套液瓶以重复使用溶剂。

接下来，使用带有旋转金刚石锯片的毛细管柱切割机，正确切割具有紫外线检测窗口的CE-MS毛细管的两端。然后用打火机去除两端两到三厘米的聚酰亚胺涂层，并用异丙醇清洁毛细管表面。要安装毛细管，请将毛细管匹配到CE-MS盒中。

然后单击“更换盒式磁带”按钮并将磁带安装到CE设备中。要激活毛细管，首先用一摩尔氢氧化钠冲洗毛细管，然后用水冲洗10分钟，然后CE电泳缓冲液15分钟。接下来，将毛细管插入CE-MS喷雾器中。

使用放大镜和喷雾器中的调节螺钉，精确调节毛细管出口，确保毛细管端从喷雾器尖端突出约 0.1 毫米。检查ESI喷雾器在全扫描模式下的稳定性。总离子电泳图的波动应在5%以内，然后用肌醇磷酸标准品进行试运行。

制备内标混合物后，将10微升样品与0.5微升内标混合物和CE样品瓶混合。使用补货系统时，单击“更换瓶子”按钮。将准备好的250毫升CE电泳缓冲液放入电解质瓶中。

然后点击清洁管，将补给针保持在水瓶中。设置 ESI 和 MS 参数。然后使用含有肌醇聚磷酸盐标准品混合物的源优化器优化源参数，并使用包含所有标准的MassHunter优化器进行多种反应监测设置。

接下来，对肌醇磷酸盐提取物进行运行并检查结果。设置有更多样本时的顺序。测量后，让MS处于待机模式，不要关闭液相色谱泵。

当没有护套液供应时，将 CE-ESI-MS 喷雾器更换为 LC-ESI-MS 喷雾器。对于数据分析，请打开定量分析软件并为所有样品创建一个批次。接下来，根据获取的多个反应监测数据创建一个新方法，并将碳-13肌醇磷酸盐设置为内标。

然后，检查多反应监测化合物、保留时间、内标、浓度和定性剂设置。传递验证并退出以将该方法应用于当前批处理。保存方法。

然后检查批次中的每个峰是否正确积分。否则，请手动积分峰值。将结果导出到电子表格中，并通过将阳极液峰响应与已知浓度的稳定同位素标记内标的相应峰响应进行比较，量化肌醇焦磷酸盐。

最后，用肌醇磷酸盐、提取物溶液及其体积中测得的浓度，计算绝对量，并通过细胞计数或蛋白质含量进一步标准化量。根据HCT116细胞的细胞计数和平均细胞体积计算细胞浓度。此处显示了浓度为2微摩尔的肌醇焦磷酸盐标准品的提取离子电泳图。

插入具有简化结构的哺乳动物中肌醇焦磷酸盐的代谢。这里显示了来自伦敦大学学院或伦敦大学学院的HCT116细胞的CE-ESI-MS运行。CE-MS用于量化UCL和NIH的HCT116细胞之间IP8水平的变化。

UCL的HCT116细胞的IP8水平比NIH高七倍。HCT116 UCL单元中1，5-IP8的显着积累与1-IP7的显着增加并行。来自NIH的氟化钠处理的HCT116细胞的CE-ESI-MS分析显示升高5-IP7，同时IP6降低和5-PPIP4外观。

尽管1-IP7的水平在一定程度上有所下降，但在氟化钠处理的细胞中并非完全不存在，但大多在检测限以下。形成稳定的CE-ESI-MS等级非常重要。我们建议在测量前检查系统的可重复性和灵敏度。

该技术允许提供肌醇磷酸盐代谢， 植入物和组织， 也提供了仔细研究生物学相关的肌醇焦磷酸盐的机会.