이것은 우리가 지금까지 테스트 한 모든 유기체에서 이노시톨 인산염 대사에 대한 고품질 결과를 제공합니다. 또한 우리가 현재 알고 있는 새로운 세포 생합성 경로에 대한 통찰력을 제공할 것입니다. CE-ESI-MS에 의한 이노시톨 인산염 대사 분석은 더 빠르고 매우 민감하며 이노시톨 인산염 어셈블리에 대한 구조 정보를 제공할 수 있습니다.
시작하려면 상용 CE 시스템과 애질런트 제트 스트림 ESI 소스가 장착된 삼중 사중극자 탠덤 질량분석기로 구성된 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석기 또는 CE-ESI-MS 시스템을 설정하십시오. 다음으로, 시스 흐름 1:100 스플리터와 등용매 액체 크로마토그래피 펌프 배출구를 연결하고 CE 시스템 입구 바이알이 질량 분석기의 분무기 팁과 동일한 높이에 있는지 확인합니다. 그런 다음 MassHunter 워크스테이션 버전 또는 유사한 MS 소프트웨어를 활용하여 전체 시스템과 데이터 수집 및 분석을 제어합니다.
CE 실행 버퍼 및 시스 액체를 준비한 후 분당 5밀리리터로 5분 동안 퍼지하여 시스 액체를 설치합니다. 그런 다음 유량을 분당 1 밀리리터로 설정하고 펌프 압력을 180 bar로 설정하십시오. 재활용 튜브가 외피 액체 병에 다시 연결되어 용매를 재사용하는지 확인하십시오.
다음으로, 회전하는 다이아몬드 블레이드가 있는 모세관 컬럼 커터를 사용하여 UV 감지 창이 있는 CE-MS 모세관의 양쪽 끝을 적절하게 절단합니다. 그런 다음 라이터로 양쪽 끝의 2-3 센티미터의 폴리이 미드 코팅을 제거하고 이소프로판올로 모세관 표면을 청소하십시오. 모세관을 설치하려면 모세관을 CE-MS 카세트에 맞춥니다.
그런 다음 카세트 변경 버튼을 클릭하고 카세트를 CE 장치에 설치합니다. 모세관을 활성화하려면 먼저 모세관을 1몰 수산화나트륨으로 세척한 다음 물을 10분 동안 세척한 다음 CE 실행 버퍼를 15분 동안 세척합니다. 그런 다음 모세관을 CE-MS 분무기에 삽입합니다.
돋보기와 분무기의 조정 나사를 사용하여 모세관 배출구를 정밀하게 조정하여 모세관 끝이 분무기 끝에서 약 0.1mm 돌출되도록 합니다. 전체 스캔 모드에서 ESI 분무기의 안정성을 확인하십시오. 총 이온 전기 페로그램의 변동은 5% 이내여야 합니다그런 다음 이노시톨 인산염 표준물질로 테스트 실행을 수행합니다.
내부 표준물질 혼합물을 준비한 후, 10 마이크로리터의 샘플을 0.5 마이크로리터의 내부 표준물질 혼합물 및 CE 샘플 바이알과 혼합한다. 보충 시스템을 사용할 때는 병 변경 버튼을 클릭하십시오. 준비된 250ml의 CE 러닝 버퍼를 전해질 병에 넣습니다.
그런 다음 보충 바늘을 물병에 보관하는 클린 튜브를 클릭하십시오. ESI 및 MS 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 이노시톨 폴리포스페이트 표준물질이 혼합된 소스 옵티마이저를 사용하여 소스 파라미터를 최적화하고 모든 표준물질과 함께 MassHunter Optimizer를 사용하여 다중 반응 모니터링 설정을 최적화합니다.
다음으로, 이노시톨 포스페이트 추출물에 대한 실행을 수행하고 결과를 확인하십시오. 샘플이 더 많은 경우 시퀀스를 설정합니다. 측정 후 MS를 대기 모드로 설정하고 액체 크로마토 그래피 펌프를 끄지 마십시오.
외피 액체 공급이 없을 때 CE-ESI-MS 분무기를 LC-ESI-MS 분무기로 교체하십시오. 데이터 분석을 위해 정량 분석 소프트웨어를 열고 모든 샘플에 대한 배치를 생성합니다. 다음으로, 획득한 다중 반응 모니터링 데이터로부터 새로운 분석법을 만들고 탄소-13 이노시톨 포스페이트를 내부 표준물질로 설정합니다.
그런 다음 다중 반응 모니터링 화합물, 머무름 시간, 내부 표준물질, 농도 및 한정자 설정을 확인하십시오. 유효성 검사 및 종료를 전달하여 현재 일괄 처리에 메서드를 적용합니다. 메서드를 저장합니다.
그런 다음 배치의 각 피크가 올바르게 통합되었는지 확인합니다. 그렇지 않으면 피크를 수동으로 통합합니다. 결과를 스프레드시트로 내보내고 양극액의 피크 반응을 알려진 농도의 안정 동위원소 표지된 내부 표준물질의 각각의 피크 반응과 비교하여 이노시톨 피로인산염을 정량화합니다.
마지막으로, 이노시톨 포스페이트, 추출물 용액 및 그 부피에서 측정 된 농도로 절대량을 계산하고 세포 수 또는 단백질 함량으로 양을 추가로 정규화합니다. HCT116 세포의 세포 수 및 평균 세포 부피를 기반으로 세포 농도를 계산합니다. 2 마이크로 몰 농도에서 이노시톨 피로 인산염 표준의 추출 된 이온 전기 페로 그램이 여기에 표시됩니다.
단순화 된 구조를 가진 포유류에서 이노시톨 피로 포스페이트의 대사가 삽입됩니다. University College London 또는 UCL의 HCT116 셀의 CE-ESI-MS 실행이 여기에 표시됩니다. CE-MS는 UCL의 HCT116 세포와 NIH의 세포 사이의 IP8 수준의 변화를 정량화하는 데 사용되었습니다.
UCL의 HCT116 세포는 NIH의 세포보다 7 배 높은 수준의 IP8을 함유하고 있습니다. HCT116 UCL 셀에서 1, 5-IP8의 상당한 축적은 1-IP7의 상당한 증가와 병행한다. NIH의 불화 나트륨 처리 HCT116 세포의 CE-ESI-MS 분석은 IP6의 감소 및 5-PPIP4의 출현과 함께 5-IP7의 상승을 보여주었습니다.
1-IP7의 수준은 어느 정도 감소했지만 불화 나트륨 처리 된 세포에는 완전히 존재하지 않지만 대부분 검출 한계 미만입니다. 안정적인 CE-ESI-MS 등급을 형성하는 것이 중요합니다. 측정하기 전에 시스템의 반복성과 감도를 확인하는 것이 좋습니다.
이 기술은 이노시톨 인산염 대사, 임플란트 및 조직을 제공하고 생물학적으로 관련된 이노시톨 피로 인산염을 면밀히 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.
