これにより、これまでにテストしたすべての生物のイノシトールリン酸代謝に高品質の結果が得られます。.また、私たちが現在認識している新しい細胞生合成経路への洞察も提供します。CE-ESI-MSによるイノシトールリン酸代謝の分析は、より速く、高感度であり、イノシトールリン酸集合体の構造情報を提供することができます。
まず、商用CEシステムと、アジレントジェットストリームESIソースを備えたトリプル四重極タンデム質量分析計で構成されるキャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析またはCE-ESI-MSシステムをセットアップします。次に、シースフロー1:100スプリッターとアイソクラティック液体クロマトグラフィーポンプ出口を接続し、CEシステムの入口バイアルが質量分析装置の噴霧器先端と同じ高さにあることを確認します。次に、MassHunterワークステーションバージョンまたは同様のMSソフトウェアを利用して、システム全体とデータの取得と分析を制御します。
CEランニングバッファーとシース液を調製した後、毎分5ミリリットルで5分間パージしてシース液を取り付けます。次に、流量を毎分1ミリリットルに設定し、ポンプ圧力を180バールに設定します。リサイクルされたチューブがシースリキッドボトルに接続して、溶剤を再利用していることを確認してください。
次に、回転するダイヤモンドブレードを備えたキャピラリーカラムカッターを使用して、UV検出ウィンドウを備えたCE-MSキャピラリーの両端を適切に切断しました。次に、両端の2〜3センチメートルのポリイミドコーティングをライターで取り除き、キャピラリー表面をイソプロパノールできれいにします。キャピラリーを取り付けるには、キャピラリーをCE-MSカセットに合わせます。
次に、[カセットの変更]ボタンをクリックして、カセットをCEデバイスに取り付けます。キャピラリーを活性化するには、最初にキャピラリーを1モルの水酸化ナトリウムで洗い流し、次に水を10分間、次にCEランニングバッファーを15分間流します。次に、キャピラリーをCE-MS噴霧器に挿入します。
虫眼鏡と噴霧器の調整ネジを使用して、毛細管出口を正確に調整し、毛細管の端が噴霧器の先端から約0.1ミリメートル突き出るようにします。フルスキャンモードでのESI噴霧器の安定性を確認してください。全イオン電泳電図の変動は5%以内でなければなりません次に、イノシトールリン酸基準で試運転を行います。
内部標準混合物を調製した後、10マイクロリットルのサンプルを0.5マイクロリットルの内部標準混合物およびCEサンプルバイアルと混合する。補充システムを使用する場合は、[ボトルの変更]ボタンをクリックします。調製した250ミリリットルのCEランニングバッファーを電解質ボトルに入れます。
次に、補充針を水バイアルに入れたままのクリーンチューブをクリックします。ESI および MS パラメータを設定します。次に、イノシトールポリリン酸標準の混合物を使用したソースオプティマイザーを使用してソースパラメーターを最適化し、すべての標準でMassHunterオプティマイザーを使用して複数の反応モニタリング設定を最適化します。
次に、イノシトールリン酸抽出物について実行を実行し、結果を確認します。サンプル数が多い場合は、シーケンスを設定します。測定後、MSをスタンバイモードにし、液体クロマトグラフィーポンプをオフにしないでください。
シース液が供給されていない場合は、CE-ESI-MS噴霧器をLC-ESI-MS噴霧器と交換してください。データ分析のために、定量分析ソフトウェアを開き、すべてのサンプルのバッチを作成します。次に、取得した多重反応モニタリングデータから新規メソッドを作成し、内部標準としてCarbon-13イノシトールホスフェートを設定した。
次に、多重反応モニタリング化合物、保持時間、内部標準、濃度、および修飾子のセットアップを確認します。検証と終了を渡して、メソッドを現在のバッチに適用します。メソッドを保存します。
次に、バッチ内の各ピークが正しく積分されているかどうかを確認します。それ以外の場合は、ピークを手動で積分します。結果をスプレッドシートにエクスポートし、陽極液のピーク応答を既知の濃度で安定同位体標識された内部標準のそれぞれのピーク応答と比較することにより、ピロリン酸イノシトールを定量します。
最後に、イノシトールリン酸中の測定濃度を用いて、溶液およびその体積を抽出し、絶対量を計算し、さらに細胞数またはタンパク質含有量によって量を正規化する。HCT116細胞の細胞数と平均細胞体積に基づいて細胞濃度を計算します。2マイクロモルの濃度で抽出されたイノシトールピロリン酸標準のイオンエレクトロフェログラムがここに示されています。
単純化された構造を有する哺乳動物におけるイノシトールピロリン酸の代謝が挿入される。ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンまたはUCLのHCT116細胞のCE-ESI-MSランを以下に示します。CE-MSは、UCLのHCT116細胞とNIHの細胞の間のIP8レベルの変動を定量化するために使用されました。
UCLのHCT116セルには、NIHの7倍のIP8が含まれています。HCT116 UCLセルにおける1,5-IP8の有意な蓄積は、1-IP7のかなりの増加と並行している。NIHのフッ化ナトリウム処理HCT116細胞のCE-ESI-MS分析では、IP6の減少と5-PPIP4の出現とともに、5-IP7の上昇が示されました。
1-IP7のレベルはある程度低下しましたが、フッ化ナトリウム処理細胞に完全に存在しないわけではありませんが、ほとんどが検出限界下にあります。安定したCE-ESI-MSグレードを形成することが重要です。測定前にシステムの再現性と感度を確認することをお勧めします。
この技術は、イノシトールリン酸代謝、インプラントおよび組織を提供することを可能にし、また生物学的に関連するイノシトールピロリン酸を綿密に研究する機会を提供する。
