Bu, şimdiye kadar test ettiğimiz tüm organizmalarda inositol fosfat metabolizması için yüksek kaliteli sonuçlar sağlar. Ayrıca, şu anda farkında olduğumuz yeni hücresel biyosentetik yol hakkında fikir verecektir. İnositol fosfat metabolizmasının CE-ESI-MS ile analizi daha hızlı, oldukça hassastır ve inositol fosfat düzenekleri için yapı bilgisi sağlayabilir.
Başlamak için, ticari bir CE sisteminden oluşan bir Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi veya CE-ESI-MS sistemi ve bir Agilent Jet Stream ESI kaynağı ile donatılmış üçlü bir dörtlü dörtlü tandem kütle spektrometresi kurun. Daha sonra, kılıf akışı 1:100 ayırıcıyı ve izokratik sıvı kromatografisi pompa çıkışını bağlayın ve CE sistemi giriş şişesinin kütle analizörünün püskürtücü ucuyla aynı yükseklikte olduğundan emin olun. Ardından, tüm sistemi ve veri toplama ve analizini kontrol etmek için MassHunter Workstation sürümünü veya benzer MS yazılımını kullanın.
CE çalışma tamponunu ve kılıf sıvısını hazırladıktan sonra, kılıf sıvısını beş dakika boyunca dakikada beş mililitrede temizleyerek takın. Ardından akış hızını dakikada bir mililitreye ve pompa basıncını 180 bar'a ayarlayın. Geri dönüştürülmüş borunun, çözücüyü yeniden kullanmak için kılıf sıvı şişesine geri bağlandığından emin olun.
Daha sonra, dönen elmas bıçaklı bir kılcal kolon kesici kullanarak, bir UV algılama penceresiyle bir CE-MS kılcal damarının her iki ucunu düzgün bir şekilde kesin. Daha sonra her iki uçtaki iki ila üç santimetre poliimid kaplamayı daha hafif bir şekilde çıkarın ve kılcal yüzeyi İzopropanol ile temizleyin. Kılcal damarı monte etmek için, kılcal damarı CE-MS kasetiyle eşleştirin.
Ardından Kaseti Değiştir düğmesine tıklayın ve kaseti CE cihazına takın. Kılcal damarı aktive etmek için, önce kılcal damarı bir molar sodyum hidroksit ile yıkayın, ardından 10 dakika boyunca su ve ardından 15 dakika boyunca CE çalışma tamponu ile yıkayın. Ardından, kılcal damarı CE-MS püskürtücüsüne yerleştirin.
Bir büyüteç ve püskürtücüdeki ayar vidasını kullanarak, kılcal çıkışı hassas bir şekilde ayarlayarak kılcal ucun püskürtücü ucundan yaklaşık 0,1 milimetre dışarı çıkıntı yapmasını sağlayın. ESI püskürtücünün stabilitesini Tam Tarama modunda kontrol edin. Toplam iyon elektroferogramlarının dalgalanması% 5 içinde olmalıdırDaha sonra, inositol fosfat standartları ile bir test çalışması yapın.
İç standartlar karışımını hazırladıktan sonra, numunenin 10 mikrolitresini 0,5 mikrolitre iç standartlar karışımı ve bir CE numune şişesi ile karıştırın. Yenileme sistemini kullanırken, Şişeyi Değiştir düğmesine tıklayın. Hazırlanan 250 mililitre CE çalışma tamponunu elektrolit şişesine koyun.
Ardından, yenileme iğnesini bir su şişesinde tutan Temiz Tüpler'e tıklayın. ESI ve MS parametrelerini ayarlayın. Ardından, inositol polifosfat standartlarının bir karışımına sahip bir kaynak optimize edici ve tüm standartlarla MassHunter Optimizer kullanarak çoklu reaksiyon izleme ayarları kullanarak kaynak parametrelerini optimize edin.
Daha sonra, inositol fosfat ekstraktları için bir çalışma yapın ve sonuçları kontrol edin. Daha fazla örnek olduğunda bir sıra ayarlayın. Ölçümden sonra, MS'in Bekleme modunda olmasına izin verin ve sıvı kromatografisi pompasını kapatmayın.
Kılıf sıvı beslemesi olmadığında CE-ESI-MS duasını bir LC-ESI-MS duası ile değiştirin. Veri analizi için Kantitatif Analiz yazılımını açın ve tüm numuneler için bir toplu iş oluşturun. Daha sonra, elde edilen çoklu reaksiyon izleme verilerinden yeni bir yöntem oluşturun ve Karbon-13 inositol fosfatlarını iç standartlar olarak ayarlayın.
Ardından, Çoklu Reaksiyon İzleme Bileşiği, Tutma Süresi, dahili standartlar, Konsantrasyon ve Niteleyici kurulumunu kontrol edin. Yöntemi geçerli toplu işleme uygulamak için Doğrulama ve Çıkış'ı geçin. Yöntemi kaydedin.
Ardından, partideki her tepe noktasının doğru şekilde entegre edilip edilmediğini kontrol edin. Aksi takdirde, tepe noktasını manuel olarak entegre edin. Sonuçları bir elektronik tabloya aktarın ve anolit tepe tepkisini, bilinen konsantrasyonlara sahip kararlı izotop etiketli iç standartların ilgili tepe tepkisiyle karşılaştırarak inositol pirofosfatları ölçün.
Son olarak, inositol fosfatta ölçülen konsantrasyonla, çözeltiyi ve hacmini ekstrakte edin, mutlak miktarları hesaplayın ve miktarı hücre sayımlarına veya protein içeriğine göre normalleştirin. HCT116 hücrelerinin hücre sayılarına ve ortalama hücre hacmine göre hücresel konsantrasyonu hesaplayın. İki mikromol konsantrasyonunda inositol pirofosfat standartlarının ekstrakte edilmiş iyon elektroferogramları burada gösterilmiştir.
Memelilerde inositol pirofosfatların basitleştirilmiş yapıları ile metabolizması eklenir. University College London veya UCL'den HCT116 hücrelerinin bir CE-ESI-MS çalışması burada gösterilmiştir. CE-MS, UCL'den HCT116 hücreleri ile NIH'den gelen hücreler arasındaki IP8 seviyelerindeki varyasyonu ölçmek için kullanıldı.
UCL'den HCT116 hücreleri, NIH'den gelenlerden yedi kat daha yüksek IP8 seviyeleri içerir. HCT116 UCL hücrelerinde 1, 5-IP8'in önemli ölçüde birikmesi, 1-IP7'deki önemli bir artışla paraleldir. NIH'den sodyum florür ile muamele edilmiş HCT116 hücrelerinin CE-ESI-MS analizi, IP6'da bir azalma ve 5-PPIP4 görünümü ile birlikte 5-IP7'lik bir yükselme göstermiştir.
1-IP7 seviyeleri bir dereceye kadar azalmış olsa da, sodyum florürle muamele edilmiş hücrelerde tamamen bulunmamakla birlikte, çoğunlukla tespit sınırının altındadır. Kararlı bir CE-ESI-MS derecesi oluşturmak önemlidir. Ölçümlerden önce sistemin tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini kontrol etmenizi öneririz.
Bu teknik, inositol fosfat metabolizmasının, implantların ve dokuların sağlanmasına izin verir ve ayrıca biyolojik olarak ilgili inositol pirofosfatı yakından incelemek için bir fırsat sağlar.
