Этот протокол предназначен для определения постохондриальной локализации дрожжевых митохондриальных белков, которая рассматривается как фундаментальный этап при выяснении функции митохондриального белка. Протокол подходит для наших штаммов дрожжей, поддерживаемых в различных условиях роста. Представляя собой мощный инструмент для исследований, как изучение митохондрий.
Начнем с того, что клетки из запаса глицерина, хранящегося при 80 ° C, попадают на агаровую пластину YPD, чтобы изолировать отдельные колонии от интересующего штамма. И высиживать пластину при 30 С в течение 2 - 3 дней. Приготовьте закваску, инокуляя от 2 до 3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в колбу Эрленмейера объемом 100 мл, содержащую от 10 до 30 мл среды YPGal.
Инкубируйте колбу при 30 С в течение 24 часов с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин. Разбавляют закваски в 1 л свежей среды YPGal до оптической плотности менее 0,1 при 600 нм. Культивируют клетки при 30 С с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин в течение примерно 12 часов, пока оптическая плотность не достигнет от 1 до 1,5.
Выполняют выделение высокоочищенных митохондрий, как описано в тексте. И определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата, используя анализ Брэдфорда, следуя инструкциям производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг/мл с помощью ледяного буфера SEM.
Переложите 40 л высокоочищенных митохондрий в четыре предварительно охлажденные и меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл. Добавьте 360 л SEM-буфера в первую и вторую пробирки. И 360 л ЭМ-буфера в третьей и четвертой пробирках.
Используя схему пипетирования, согласно тексту, добавляют 4 л свежеприготовленной протеиназы К во вторую и четвертую пробирки. После осторожного перемешивания всех пробирок высиживать на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием. Для остановки активности протеиназы К добавляют во все четыре пробирки 4 л 200 мМ PMSF.
Центрифугируйте пробирки по 20 000 х г в течение 30 минут при 4 С. И соберите супернатант, не нарушая гранулу, в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Затем повторно суспендируйте гранулу в 400 л ледяного SEM-буфера. Чтобы инактивировать возможные следы протеиназы К, осадите собранный супернатант и повторно суспендируйте гранулу трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10%, инкубируйте пробирки на льду в течение 10 минут.
Центрифугируют обработанные трихлоруксусной кислотой образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. А после удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в 200 л буфера образца. Если бромфенол синий становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим. Добавьте 4 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам.
Храните образцы при температуре 80 ° C до дальнейшего анализа с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Переложите 200 л высокоочищенных митохондрий в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.
Используя ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами, обрабатывайте митохондрии ультразвуком 3 раза в течение 30 секунд на льду. Центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. И соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. После маркировки трубки как S" для растворимой белковой фракции держите трубку на льду.
Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. Переложите 100 л повторно суспендированной гранулы в новую пробирку предварительно охлажденной микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Пометьте трубку как SMP" для фракции постохондриальных частиц и держите трубку на льду.
Оставшиеся 300 л повторно суспендированных гранул раз разбавить свежеприготовленным 200 мМ карбонатом натрия. И высиживать разбавленный образец на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. Соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
Пометьте образец как CS" для фракции карбонатного супернатанта и держите трубку на льду. Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. И назовите образец CP" для карбонатной осажденной фракции.
Осадите все образцы трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10% и инкубируйте трубки на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируют образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. После удаления супернатанта повторно суспендируют каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.
Добавьте 1 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам и храните при 80 ° C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Сырую митохондриальную фракцию очищали при центрифугировании градиента плотности сахарозы и наблюдалось уменьшение других клеточных загрязнений. Превращение митохондрий в митопласт контролировали исчезновением межмембранного космического белка цитохрома b2 в грануле.
С сопутствующим появлением в супернатанте. Опосредованная протеиназой К деградация межмембранного белка Sco1 наблюдалась из-за разрушения наружной мембраны осмотическим шоком. Целостность внешней митохондриальной мембраны была подтверждена защитой цитохрома b2 и Sco1 от деградации протеиназы K в гранулированной фракции.
Аналогичным образом, защита матриксного растворимого белка KGD подтвердила целостность внутренней митохондриальной мембраны. Профиль западного пятна Prx1 предполагал двойную митохондриальную локализацию в межмембранном пространстве и матрице. Митохондрии подвергали ультразвуковой обработке и карбонатной экстракции для исследования топологии мембранных белков.
Интегральная мембранная белковая заливка осталась в гранулированных фракциях. КГД был обнаружен в надводной фракции. Обнаружение белка KGD в гранулах было обусловлено изменениями параметров ультразвуковой обработки, влияющими на образование SMP.
После обработки карбонатом натрия KGD и фракцию SMP солюбилизировали и обнаружили в фракции надосадочных веществ. Профиль западного пятна Prx1 предполагает ассоциацию с периферией мембраны. Для успеха протокола индохондриального фракционирования важно остановить активность протеиназы К после гипотонического отека путем добавления PMSF в образцы.
Сайты предоставляют информацию о локализации белка субтохондрий. Этот протокол также может быть использован для проверки целостности митохондриальных препаратов, что является фундаментальным при протеомных исследованиях митохондриальных подкомпартментов.
