Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die submitochondriale Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen zu bestimmen, die als grundlegender Schritt während der mitochondrialen Proteinfunktionsaufklärung angesehen wird. Das Protokoll eignet sich für unsere Hefestämme, die unter verschiedenen Wachstumsbedingungen gehalten werden. Stellt ein mächtiges Werkzeug für die Forschung wie das Studium der Mitochondrien dar.
Zunächst streifen Sie Zellen aus glycerinhaltigem Bestand, die bei 80 ° C gelagert werden, auf eine YPD-Agarplatte, um einzelne Kolonien von dem interessierenden Stamm zu isolieren. Und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C für 2 bis 3 Tage. Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie 2 bis 3 einzelne Kolonien aus YPD-Agarplatte in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit 10 bis 30 ml YPGal-Medium impfen.
Inkubieren Sie den Kolben bei 30 ° C für 24 Stunden unter kräftigem Schütteln bei 180 bis 200 U / min. Verdünnen Sie die Starterkultur in 1 l frisches YPGal-Medium auf eine optische Dichte von weniger als 0,1 bei 600 nm. Kultivieren Sie die Zellen bei 30 ° C mit kräftigem Schütteln bei 180 bis 200 U / min für etwa 12 Stunden, bis die optische Dichte 1 bis 1,5 erreicht.
Führen Sie die Isolierung von hochreinen Mitochondrien durch, wie im Text beschrieben. Und bestimmen Sie die Proteinkonzentration des hochgereinigten mitochondrialen Präparats mit dem Bradford-Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Proteinkonzentration mit eiskaltem REM-Puffer auf 10 mg/ml ein.
40 l hochreine Mitochondrien werden in vier 1,5 ml vorgekühlte und markierte Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. 360 l REM-Puffer in das erste und zweite Röhrchen geben. Und 360 l EM-Puffer in der dritten und vierten Röhre.
Fügen Sie unter Verwendung des Pipettierschemas gemäß dem Text 4 l frisch zubereitete Proteinase K in das zweite und vierte Röhrchen hinzu. Nachdem Sie alle Röhrchen vorsichtig gemischt haben, inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis mit gelegentlichem Mischen. Um die Proteinase-K-Aktivität zu stoppen, fügen Sie allen vier Röhrchen 4 l 200 mM PMSF hinzu.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 Minuten bei 4 ° C.Und sammeln Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, in ein neues 1,5 ml vorgekühltes markiertes Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in 400 l eiskaltem REM-Puffer. Um die möglichen Spuren der Proteinase K zu inaktivieren, den gesammelten Überstand auszufällen und das Pellet mit Trichloressigsäure auf eine Endkonzentration von 10% zu resuspenieren, inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis.
Zentrifugieren Sie die mit Trichloressigsäure behandelten Proben für 10 Minuten bei 12.000 x g bei 4 C.Und nach dem Entfernen des Überstandes das Pellet in 200 l Probenpuffer resuspen. Wenn das Bromphenolblau gelb wird, fügen Sie 1 bis 5 l 1 M Tris Base hinzu, bis es blau wird. Fügen Sie 4 l 200 mM PMSF zu allen Rohren hinzu.
Lagern Sie die Proben bei 80 ° C bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot. 200 l hochreine Mitochondrien werden in ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Verdünnen Sie die Mitochondrien einfach mit eiskaltem REM-Puffer.
Verwenden Sie einen Ultraschallgerät, das mit kleinen Volumina kompatibel ist, und beschallen Sie die Mitochondrien 3 Mal für 30 Sekunden auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe für 30 Minuten bei 100.000 x g bei 4 C.Und sammeln Sie den Überstand in einem neuen 1,5 ml vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen. Nachdem Sie das Röhrchen als S "für lösliche Proteinfraktion markiert haben, halten Sie das Röhrchen auf Eis.
Resuspendieren Sie das Pellet aus dem vorherigen Schritt in 400 l eiskaltem REM-Puffer. 100 l des resuspendierten Pellets in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen geben. Kennzeichnen Sie das Röhrchen als "SMP" für die Fraktion der submitochondrialen Partikel und halten Sie das Röhrchen auf Eis.
Die restlichen 300 l resuspendiertes Pellet werden einfach mit frisch zubereitetem 200 mM Natriumcarbonat verdünnt. Und die verdünnte Probe 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die Probe für 30 Minuten bei 100.000 x g bei 4 C.Sammeln Sie den Überstand in einem neuen 1,5 ml vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen.
Kennzeichnen Sie die Probe als CS" für die Carbonat-Überstandsfraktion und halten Sie das Röhrchen auf Eis. Resuspendieren Sie das Pellet aus dem vorherigen Schritt in 400 l eiskaltem REM-Puffer. Und nennen Sie die Probe als CP "für Karbonat ausgefällte Fraktion.
Alle Proben mit Trichloressigsäure auf eine Endkonzentration von 10% niederschlagen und die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei 12.000 x g bei 4 ° C.Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspen sie jedes Pellet im Probenpuffer. Wenn der Probenpuffer gelb wird, fügen Sie 1 bis 5 l 1 M Tris-Base hinzu, bis sie blau wird.
1 l 200 mM PMSF zu allen Rohren geben und bei 80 ° C bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot lagern. Die rohe mitochondriale Fraktion wurde durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation gereinigt, und es wurde eine Verringerung anderer zellulärer Kontaminanten beobachtet. Die Umwandlung von Mitochondrien in Mitoplasten wurde durch das Verschwinden des Intermembran-Weltraumproteins Cytochrom b2 im Pellet überwacht.
Mit dem gleichzeitigen Auftreten im Überstand. Der Proteinase-K-vermittelte Abbau des Intermembranproteins Sco1 wurde aufgrund einer Störung der äußeren Membran durch osmotischen Schock beobachtet. Die Integrität der äußeren mitochondrialen Membran wurde durch den Schutz von Cytochrom b2 und Sco1 gegen den Abbau von Proteinase K in der Pelletfraktion bestätigt.
Ebenso bestätigte der Schutz des matrixlöslichen Proteins KGD die Integrität der inneren mitochondrialen Membran. Das Prx1-Western-Blot-Profil deutete auf eine duale mitochondriale Lokalisation im Intermembranraum und in der Matrix hin. Mitochondrien wurden Ultraschall und Karbonatextraktion unterzogen, um die Topologie von Membranproteinen zu untersuchen.
Das integrale Membranproteingießen verblieb in den Pelletfraktionen. Die KGD wurde in der überstehenden Fraktion nachgewiesen. Der Nachweis des KGD-Proteins im Pellet war auf Schwankungen der Beschallungsparameter zurückzuführen, die die Bildung von SMPs beeinflussten.
Nach der Natriumcarbonatbehandlung wurde die KGD- und die SMP-Fraktion gelöst und in der überstehenden Fraktion gefunden. Das Prx1-Western-Blot-Profil deutete auf eine Assoziation mit der Membranperipherie hin. Für den Erfolg des submitochondrialen Fraktionierungsprotokolls ist es wichtig, die Proteinase-K-Aktivität nach hypotoner Schwellung durch Zugabe von PMSF zu den Proben zu stoppen.
Websites liefern Informationen über die lokalisierung des submitochondrialen Proteins. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die Integrität von mitochondrialen Präparaten zu überprüfen, was bei proteomischen Studien von mitochondrialen Unterkompartimenten von grundlegender Bedeutung ist.
