测量重组透气溶性细胞中线粒体底物通量 O-透化细胞

因为它测试线粒体底物通量，这些通量可能会受到不同病理或治疗的影响。例如，今天我们将用它来揭示癌细胞对二甲双胍治疗的反应。它需要最少数量的细胞，同时对每种不同的材料进行足够的重复和适当的控制。

该分析仪仅用于研究用途。该技术可以识别线粒体代谢中的错误，并可用于评估影响线粒体的战士药物。演示该程序的将是Karolina Vaneckova，她是我实验室的本科生和研究技术人员。

以每孔20， 000个细胞的密度开始接种A549细胞，在色谱柱中加入2至11个海马XF 96细胞培养微孔板。将第 1 列和第 12 列留空为背景井。用等体积的细胞培养基填充空白孔，然后将细胞在37摄氏度下在加湿的培养箱中孵育，其中含有5%二氧化碳用于细胞附着。

三到四小时后，在孔中加入100微升细胞培养基。用一毫摩尔二甲双胍处理实验组第7至11柱，用等体积的无菌蒸馏水处理对照组，然后将板返回培养箱。为了给传感器补水，将每口井200微升无菌水移入公用设施板中。

然后小心地将传感器盒放回，同时将传感器浸入水中。将墨盒在37摄氏度的无二氧化碳培养箱中孵育至第二天。打开分析仪和控制单元。

启动仪器控制和数据采集软件，并按照文本手稿中所述设计测定方案。在组定义下，创建四个注入策略，其中端口 A 根据注入的底物而不同，并在底物或缩写之后命名策略。将寡霉素分配到端口B，FCCP分配到端口C，将鱼藤酮抗霉素A混合物分配到端口D.创建并命名八个组，在板图下，将组分配给相应的孔。

然后将协议另存为即用型模板。保持分析仪开关打开，使温度在一夜之间稳定下来。第二天，丢弃公用设施板中的水，并在公用设施板中每孔添加200微升预热的校准剂。

将墨盒返回到无二氧化碳培养箱，直到测定时间。保持培养箱内的湿度源，关闭或将风扇速度降至最低，以避免校准剂快速蒸发。用预热的两次线粒体测定溶液，5%BSA和无菌水制备5毫升底物和抑制剂的工作溶液，如文本手稿中所述。

接下来，按照税务手稿中所述，在注射器端口中加载底物和抑制剂。要在运行检测选项卡下进行校准，请单击开始运行以开始检测。插入加载的审查盒并等待校准完成。

通过将两倍线粒体测定溶液，无菌水和5%BSA混合在50毫升管中，制备20毫升测定培养基。加入两微升10微摩尔重组产气溶素O，以达到1纳摩尔的浓度。并通过轻柔移液重新悬浮混合物，避免摇晃和涡旋。

将管子在37摄氏度下孵育直至使用。使用多通道移液器洗涤细胞和空空白孔两次，使用预热的无钙和镁PBS溶液。丢弃PBS并加入180微升预热的测定培养基以进行细胞透化。

通透后，立即将校准传感器盒的实用程序板替换为含有透化细胞的细胞板并开始测量。治疗组琥珀酸盐诱导呼吸的发生率较高。A549细胞对二甲双胍治疗的反应高于Hep G2。对于丙酮酸苹果酸盐诱导的呼吸，与Hep G2细胞相比，A549细胞在5至15分钟之间显示出增加的诱导作用。

谷氨酸苹果酸盐诱导呼吸和棕榈酰肉碱苹果酸盐诱导呼吸的结果相似。达到合适的底物和抑制剂浓度。必须将正确的卷加载到正确的端口中。

当确定某种底物的代谢途径发生变化时，有必要评估参与该途径的酶和转运蛋白的功能。