利用细胞外通量分析探索单个3D微组织球体的线粒体能量代谢

我们的方案允许研究人员探测线粒体能量代谢和无缝球体，以便在几种不同的细胞系，细胞数量和表型之间进行比较，以及现场药物发现和癌症研究中的药物治疗。我们的工作提出了一个详细的方案，用于探索使用3D球体进行线粒体能量代谢，与细胞单层实验相比，它提供了优越的生理模型。生物学观察可以从玻璃体球状体外推到体内肿瘤，并确定可能靶向球状肿瘤代谢的途径。

例如，碳水化合物在球体生长过程中的效用。海马细胞外通量96仪器的所有数据都非常灵敏。在测定板内定位体外球体对于获得单个球体水平的准确数据至关重要。

使用相差为4倍放大倍率的倒置光学显微镜检查球体活力，以确保样品之间的完整球体结构，形态和整体均匀性。为了给传感器滤芯补水，将大约20毫升的口径等分到锥形管中。将含有口径的锥形管置于非二氧化碳37摄氏度的培养箱中过夜。

取出测定试剂盒的内容物。将传感器滤芯倒置在公用设施板旁边。使用多通道P300移液管将200微升的无菌双蒸馏水移入实用板的每个孔中。

将传感器盒放在公用设施板的顶部。检查每个井中的水位是否高到足以淹没传感器探头。将组装好的传感器滤芯转移到非二氧化碳37摄氏度培养箱中，并放置过夜。

为了涂覆球体测定微孔板，使用化粪池技术每毫升每毫升加入30微升无菌0.1毫克的Poly-D-赖氨酸溶液。从球状微孔板的每个孔中吸出溶液，倒置板，然后将其牢固地敲击到薄纸上以除去任何残留的溶液。用200微升无菌双蒸馏水洗涤板的每个孔。

最后一次洗涤后，倒置微孔板并将其牢固地拍打到薄纸上以除去任何残留的水。让板风干30分钟，然后再使用。按照手稿中所述准备XF RPMI培养基。

在测定前一小时将补充的XF RPMI测定培养基预热至37摄氏度。并将包被的球体测定微孔板在37摄氏度的非二氧化碳培养箱中预热。从空气培养箱中取出装有口径和传感器盒的锥形管。

从实用板上取下传感器盒，并将其倒置在工作台面上。使用P300多通道移液器，从实用板中吸取水并将其丢弃。将200微升预热的口径加入到实用板的每个孔中。

将传感器盒放在实用板上，确保传感器完全浸没在校准液中。将组装好的传感器滤芯转移到非二氧化碳的37摄氏度培养箱中，直到准备好装载端口注射溶液。从培养箱中取出球体培养板，并在显微镜下观察球体，以确保它们在球体转移步骤之前的完整性。

将180微升预热测定培养基加载到球体板的每个孔中，包括任何背景校正孔。用三毫升的测定培养基部分填充七厘米的培养皿。将球状体从96孔培养板转移到培养皿中，使用装有宽孔移液器尖端的多通道移液器，体积设置为10至50微升。

将装有宽孔吸管吸头的单通道移液器的体积设置为20微升，并小心地吸出单个球体。将吸头直接放在该球状体测定微孔板的每个孔的中心，并允许毛细管作用从移液器吸头中取出球体。通过在显微镜下将移液器的内容物移回培养皿中来确认进化。

一旦所有这些球状体被转移到球状体测定微孔板中，将板转移到非二氧化碳37摄氏度的培养箱中至少一小时。使用完全补充的预热XF RPMI测定培养基，准备手稿中描述的每种化合物的工作储备浓度。使用校准的P100多通道移液器将每种化合物的20微升工作溶液分配到所有相应的端口中。

准备分析仪以装载传感器盒。为了获得形状良好的致密球体，每个细胞系都针对接种密度和培养持续时间进行了单独优化。在优化的播种策略下，SK-OV-3的球体体积约为5.46 x 10至7微米立方体，A549的球体体积为1.45 x 10至8微米立方体。

所有球体类型在初始晶种密度和球体体积之间都呈线性相关。完美的旋转椭球对称性为1.0，偏离1.0表示圆度丧失。对于所有球体类型，耗氧速率随球体大小而增加，并且与球体体积呈线性相关，MCF-7球体中最高，SK-OV-3球体中最低。

在整个实验过程中，MCF-7球体对车辆对照没有反应。在第一次注射0.5 μg/毫升后的五个测量周期后，用寡霉素降低MCF-7球体的耗氧率。作为对BAM15的回应，在第二次注射之前氧气消耗率增加。

而鱼藤酮加抗霉素A的组合降低了它。准确探测基础线粒体呼吸的方案。使用癌症衍生的3D球体开发了ADP磷酸化呼吸，泄漏呼吸，耦合效率，最大呼吸能力和备用呼吸能力。

所有呼吸化合物都产生了所选化合物的预期动氧消耗率曲线，揭示了每孔每分钟20至30皮摩尔氧的平均稳定基础呼吸速率。微孔板内球体的位置和化合物注射后的测量周期数，以确保化合物添加之间的呼吸速率稳定。当使用解耦器探索线粒体呼吸能力时，不仅是浓度的关键，而且是其在寡霉素存在下解耦呼吸的能力，寡霉素通常在探测线粒体能量代谢的实验中在解耦之前添加。