그것은 다른 병리 또는 치료에 영향을 받을 수 있는 미토콘드리아 기질 플럭스를 테스트 하기 때문에. 예를 들어, 오늘 우리는 메트포르민 치료에 암 세포 반응을 밝히기 위해 그것을 사용할 것입니다. 그것은 각 별개의 물질에 대한 충분한 복제 및 적절한 제어를 하면서 세포의 최소한의 수를 필요로한다.
분석기는 연구용전용입니다. 이 기술은 미토콘드리아 대사의 오류를 식별할 수 있으며 미토콘드리아에 영향을 미치는 전사 약물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 카롤리나 바네코바 (Karolina Vaneckova)가 내 실험실에서 학부 학생 및 연구 기술자가 될 것입니다.
종자 A549 세포를 기둥당 20, 000 세포의 밀도로 시작하려면, 해마 XF 96 세포 배양 마이크로 플레이트의 2 내지 11. 열 1과 12를 배경 우물로 비워 둡니까. 빈 우물을 세포 배양 배지의 동일한 부피로 채운 다음, 세포 부착을 위한 5%의 이산화탄소로 가습된 인큐베이터에서 37도의 세포배양증을 한다.
3~4시간 후에 Wells에 세포 배양 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 실험군 컬럼 7내지 11개를 밀리몰러 메트포르민 1개, 대조군으로 처리한 다음, 배관을 배양기로 되돌려 놓는다. 센서에 수분을 공급하기 위해 파이프 200 마이크로리터당 멸균 물을 유틸리티 플레이트에 잘 넣습니다.
그런 다음 센서카트리지를 조심스럽게 반환하면서 센서를 물에 담급니다. 다음날까지 이산화탄소 무료 인큐베이터에 카트리지를 증양합니다. 분석기와 제어 장치를 켭채합니다.
계측기 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 시작하고 텍스트 원고에 설명된 대로 분석 프로토콜을 디자인합니다. 그룹 정의에 따라, 포트 A가 주입된 기판에 따라 다른 네 가지 사출 전략을 만들고 기판 또는 약어 후 전략의 이름을 지정합니다. 포트 B, FCCP를 포트 C및 로테네 안티마이신 A 혼합물에 할당하여 플레이트 맵 아래에 있는 8개의 그룹을 포트D.Create 및 이름을 지정하여 해당 웰스에 그룹을 할당합니다.
그런 다음 템플릿을 사용할 준비가 된 프로토콜을 저장합니다. 온도가 하룻밤 사이에 안정될 수 있도록 분석기 스위치를 켜두십시오. 다음 날, 유틸리티 플레이트에서 물을 버리고 유틸리티 플레이트에 잘 당 미리 따뜻하게 교정의 200 마이크로 리터를 추가합니다.
카트리지를 분석 시간까지 이산화탄소 무료 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 인큐베이터 내부의 습도원을 유지하고 교정기의 급속한 증발을 피하기 위해 팬 속도를 최소한으로 끄거나 줄입니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 기판 및 억제제의 작동 용액 5밀리리터를 미리 따뜻하게 2회 미토콘드리아 분석 용액, 5%BSA 및 멸균물로 준비한다.
다음으로, 세무 원고에 설명된 바와 같이 기판 및 억제제로 인젝터 포트를 로드합니다. 실행 분석 탭에서 교정하려면 시작 실행을 클릭하여 분석기를 시작합니다. 로드된 검열 카트리지를 삽입하고 보정이 완료될 때까지 기다립니다.
20 밀리리터의 분석 매체를 제조하여 미토콘드리아 분석 용액, 멸균 수및 50 밀리리터 튜브에 5%BSA를 혼합하여 준비합니다. 10 마이크로 몰러 재조합 퍼프렌고리신 O의 두 마이크로 리터를 추가, 하나의 나노 몰러의 농도를 달성하기 위해. 그리고 부드러운 파이펫팅으로 혼합물을 다시 일시 중단하여 흔들림과 소용돌이를 피하십시오.
사용 전까지 37°C에서 튜브를 배양합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 전온된 칼슘과 마그네슘 프리 PBS 용액을 사용하여 셀과 빈 웰을 두 번 세척할 수 있습니다. PBS를 폐기하고 세포 투과화를 위해 미리 따뜻해진 분석 매체의 180 마이크로리터를 추가합니다.
투과화 직후 보정된 센서 카트리지의 유틸리티 플레이트를 과소 세포를 포함하는 세포판으로 교체하고 측정을 시작합니다. 치료 그룹은 간결한 유도 호흡의 더 높은 비율을 가졌다. 메트포르민 치료에 대한 A549 세포의 반응은 Hep G2보다 높았다. 피루바테 말레이트 유도 호흡의 경우, A549 세포는 5 분 에서 15 분 사이에 Hep G2 세포에 비해 증가 된 유도를 보였다.
글루타민산염 에 대한 유사한 결과를 얻어내고 호흡과 팔미토일카르니틴 성모 유도 호흡을 유도하였다. 기판과 억제제의 적절한 농도를 달성한다. 올바른 볼륨을 오른쪽 포트에 로드해야 합니다.
특정 기판의 대사 경로에 있는 변경이 확인될 때, 그 통로에 관련시키는 효소 및 수송자의 기능을 평가할 필요가 있을 것입니다.
