演示该程序的将是研究生张喆，研究专家Nannan Zhang，Illker Ozden教授和丁成华教授。该程序的总体目标是开发细胞类型特异性对星形胶质细胞和神经元以及线粒体靶向方法，用于使用遗传编码的钙指示剂GCaMP5G和6s进行体外和体内线粒体计数成像。对于体外或体内成像，我们将构建含有星形胶质细胞或神经元特异性启动子gfaABC1D或CaMKII和遗传编码钙指示剂GCaMP5G / 6s的DNA质粒，具有线粒体靶向序列。
对于体外线粒体钙成像，我们使用脂质胺方法转染在玻璃盖玻片上培养的星形胶质细胞神经元，并使用上述DNA质粒。成像可以在转染后一到两天开始，方法是在落射荧光或双光子显微镜下将玻璃盖玻片转移到普茂室。以下是来自线粒体和星形胶质细胞的荧光信号的例子，左侧是表达GCaMP6s，而对于神经元中的线粒体，右侧是GCaMP5G。
对于体内成像，我们制备了血清型5相关腺病毒用于星形胶质细胞中mito-GCaMP5G的表达，血清型9相关腺病毒用于神经元中Mito-GCaMP6s的表达。对于立体定向病毒注射手术，我们首先用3%异氟醚麻醉小鼠。在手术后期，异氟醚水平降低到2%达到适当的麻醉水平后，剃掉头皮上的头发并将鼠标定位在立体打手术器械上。
在手术过程中，将眼药膏涂在眼睛上以保护眼睛。注射手术是使用无菌程序进行的，包括无菌器械和无菌技术。手术器械通过高压灭菌或热珠灭菌器进行灭菌。
将鼠标安装在立体塔上后，用β-丁烷和70%乙醇清洁头皮三次。然后沿着Bregma Lambda轴切开表皮，并通过在目标位置上高速钻头形成垂直。在这项工作中，我们瞄准了运动皮层或皮质旁。
携带相关腺病毒载体的33号汉密尔顿注射器通过孔插入大脑，并在目标区域注射载体。对于皮质输送，我们分多个步骤在两个深度注射病毒溶液。首先，我们将针头插入一毫米深的皮层。
在大脑恢复五分钟后，我们将针头移动到700微米深处，注入500纳米升的病毒溶液。注射完成后，我们等待五分钟，让病毒在大脑中扩散。然后我们将针头向上移动到300微米深的第二个注射位置。
在这里，我们再注入500纳米升的病毒溶液。注射完成后，我们等待10分钟以使病毒扩散，然后我们从大脑中取出针头并用骨蜡或Kwik-Sil关闭毛刺孔。最后，用Vetbond缝合皮肤，并在加热垫上恢复小鼠，然后将其送回动物设施。
小鼠将在至少三周内准备好用于体内成像，这是GCaMP表达成熟的时间范围。颅窗植入手术也通过使用注射手术中描述的无菌条件来完成。颅窗外科手术与注射外科手术相同，直到颅骨暴露点。
一旦颅骨暴露在外，在病毒注射区域上方的直径为2-3毫米的开颅手术的四分之一处用连接到机械手的高速钻头制成的浅孔标记。然后，在开颅手术的峡谷处，通过小心而缓慢地将骨头钻成一圈，将这四个孔连接起来，使头骨部分变薄。一旦边界处的颅骨足够薄，然后用锋利的镊子抬起骨头并移除。
暴露的硬脑膜可以被移除或保持完整，以便植入颅窗。我们的颅窗由直径为3-5毫米的玻璃盖板组成，在中心形成一个约300微米厚的硅胶盘。颅窗的安装是通过将其放置在开颅手术上来完成的。
一根附着在操纵器上的牙签用于将颅窗轻轻推到大脑表面。然后，用少量硅胶粘剂Kwik-Sil密封颅窗的边缘。最后，用牙亚克力将颅窗固定在颅骨边缘。
应注意将牙科丙烯酸稍微涂抹在颅窗的边缘，以牢固粘合。正如许多其他研究小组过去实施的那样，可以在盖玻片和大脑之间使用1.2%琼脂糖凝胶作为硅胶盘的替代品。颅窗牢固安装后，将金属板连接到颅骨上。
该头板将用于在成像过程中将鼠标的头部固定在双光子显微镜的载物台上。星形胶质细胞中的线粒体钙摄取可以通过ATD应用引起，而神经元中的线粒体钙摄取可以通过在人工脑脊髓液中施用谷氨酸甘氨酸来引起，并通过灌注系统进行重力作用。然后可以观察到星形胶质细胞和神经元中单个线粒体中的钙摄取。
以下电影显示了左侧ATP引发的星形胶质细胞和右侧谷氨酸和甘氨酸引发的神经元中的线粒体钙摄取。成像是通过收集星形胶质细胞和神经元中线粒体荧光信号的延时体内双光子图像来完成的，该系统配备了来自Coherent的百万台Ti Sapphire Ultra一激光器。我们使用880至910纳米的激发波长，这是使用GCaMP5G和6s进行体内成像的最佳选择。
星形胶质细胞和神经元特异性表达丝裂-GCaMP5G和6s，并通过SR101或神经元特异性标记NeuN的星形胶质细胞特异性标记的共定位再次确认。星形胶质细胞和体内神经元中的自发线粒体钙摄取可以通过使用双光子显微镜的延时成像来观察。图像显示左侧星形胶质细胞和右侧神经元中单个线粒体中的钙自发增加。
我们的方法可用于体外和体内的细胞类型特异性线粒体钙成像。观看此视频后，您应该对如何对星形胶质细胞和神经元中的线粒体钙摄取进行成像有很好的了解。
