Продемонстрировать процедуру продемонстрируют аспирант Чжэ Чжан, специалист-исследователь Наннань Чжан, профессора Иллкер Озден и Шинхуа Дин. Общей целью этой процедуры является разработка специфических для клеточного типа парных астроцитов и нейронов, а также метод митохондриального таргетирования для митохондриальных показателей in vitro и in vivo с использованием генетически закодированного индикатора кальция, GCaMP5G и 6s. Для визуализации in vitro или in vivo мы построим плазмиды ДНК, содержащие специфические промоторы астроцитов или нейронов gfaABC1D или CaMKII и генетически закодированные индикаторы кальция, GCaMP5G/6s с митохондриальными целевыми последовательностями.
Для визуализации митохондриального кальция in vitro мы трансфектировали нейроны астроцитов, культивируемые на стеклянных покровах, с вышеупомянутыми плазмидами ДНК с использованием метода Lipofectamine. Визуализация может быть начата через один-два дня после трансфекции путем переноса скольжения стеклянной крышки в обильную камеру под эпифлуоресцентным или двухфотонным микроскопом. Вот примеры флуоресцентных сигналов от митохондрий и астроцита, экспрессирующего GCaMP6s слева, и для митохондрий в нейроне, экспрессирующих GCaMP5G справа.
Для визуализации in vivo мы подготовили серотип 5 ассоциированный аденовирус для экспрессии mito-GCaMP5G в астроцитах и серотипа 9 ассоциированного аденовируса для экспрессии mito-GCaMP6s в нейронах. Для операций по инъекции стереотаксического вируса мы сначала обезболили мышь 3% изофлураном. Позже во время операции уровень изофлурана снижается до 2% После достижения надлежащего уровня анестезии волосы на коже головы сбриваются, а мышь позиционируется на стереотаксном хирургическом инструменте.
Офтальмологическая мазь наносится на глаза, чтобы защитить их во время операции. Инъекционные операции выполняются с использованием асептических процедур, включая стерильные инструменты и асептические методы. Хирургические инструменты стерилизуются либо автоклавированием, либо горячим стерилизатором из бисера.
После того, как мышь установлена на стереотакс, кожу головы трижды очищают бетадином и 70% этанолом. Затем кожа разрезается вдоль оси Bregma Lambda, а вертикаль делается высокоскоростным сверлом над целевым местом. В этой работе мы нацелились либо на моторную кору, либо на паракортекс.
Шприц Гамильтона 33 калибра, несущий связанный вектор аденовируса, вводится через отверстие в мозг, и векторы вводятся в целевую область. Для корковой доставки мы вводим раствор вируса на две глубины в несколько этапов. Во-первых, мы вводим иглу на один миллиметр вглубь коры.
Дав пять минут на восстановление мозга, мы перемещаем иглу на глубину до 700 микрометров, вводим 500 нанолитров раствора вируса. После того, как инъекция завершена, мы ждем пять минут, чтобы позволить вирусу диффундировать в мозге. Затем мы перемещаем иглу ко второму месту инъекции на глубине 300 микрометров.
Здесь мы вводим еще 500 нанолитров раствора вируса. После того, как инъекция завершена, мы ждем 10 минут, чтобы позволить вирусу диффундировать, а затем мы извлекаем иглу из мозга и закрываем отверстие заусенца костным воском или Kwik-Sil. Наконец, кожа зашивается Vetbond, и мышь восстанавливается на грелке перед отправкой обратно в учреждение для животных.
Мышь будет готова к использованию для визуализации in vivo как минимум через три недели, что является временным интервалом, в течение которого созревает экспрессия GCaMP. Операции по имплантации черепного окна также выполняются с использованием асептических условий, как описано для инъекционных операций. Хирургические процедуры черепного окна идентичны инъекционным хирургическим процедурам до момента воздействия на череп.
После того, как череп обнажен, четверти трепанации диаметром 2-3 мм над областью инъекции вируса помечаются четырьмя неглубокими отверстиями, сделанными высокоскоростным сверлом, прикрепленным к манипулятору. Затем участок черепа, в ущельях трепанации черепа, истончаются путем тщательного и медленного сверления кости вокруг по кругу, соединяя эти четыре отверстия. Как только череп у границ становится достаточно тонким, затем кость поднимается острым пинцетом и удаляется.
Открытая твердая мозговая оболочка может быть удалена или сохранена неповрежденной для имплантации краниального окна. Наше черепное окно состоит из стеклянной крышки диаметром 3-5 миллиметров, создавая силиконовый диск толщиной около 300 микрон в центре. Монтаж краниального окна осуществляется путем размещения его над краниотомией.
Кусок зубочистки, прикрепленный к манипулятору, используется для мягкого выталкивания краниального окна на поверхность мозга. Затем край краниального окна герметизируется небольшим количеством силиконового клея Kwik-Sil. Наконец, краниальное окно фиксируется по краям черепа зубным акрилом.
Следует позаботиться о нанесении зубного акрила немного по краям краниального окна для прочного склеивания. Как и многие другие исследовательские группы в прошлом, 1,2% агарозный гель можно использовать между покровным стеклом и мозгом в качестве альтернативы силиконовому диску. После того, как черепное окно надежно установлено, к черепу крепится металлическая пластина.
Эта головная пластина будет использоваться для фиксации головки мыши на стадии двухфотонного микроскопа во время сеансов визуализации. Поглощение митохондриального кальция в астроцитах может быть вызвано применением ATD, в то время как поглощение митохондриального кальция в нейронах может быть вызвано применением глутамата глицина в искусственной спинномозговой жидкости головного мозга с гравитацией через перфузионную систему. Затем можно наблюдать поглощение кальция в отдельных митохондриях в астроцитах и нейронах.
Следующие фильмы показывают поглощение митохондриального кальция в астроците, вызванном АТФ слева, и в нейроне, вызванном глутаматом и глицином справа. Визуализация выполняется путем сбора покадровых in vivo двухфотонных изображений митохондриальных флуоресцентных сигналов в астроцитах и нейронах с помощью двухфотонной системы микроскопии Ultima от Prairie Technologies, которая оснащена миллионом Ti Sapphire Ultra one лазером от Coherent. Мы используем длины волн возбуждения от 880 до 910 нанометров, которые оптимальны для визуализации in vivo с GCaMP5G и 6s.
Астроциты и нейрон-специфическая экспрессия мито-GCaMP5G и 6s подтверждены колокализацией астроцитарно-специфической маркировки SR101 или нейрон-специфического маркера NeuN. Спонтанное поглощение митохондриального кальция в астроцитах и нейронах in vivo можно наблюдать с помощью покадровой визуализации с использованием двухфотонной микроскопии. Изображения показывают спонтанное увеличение кальция в отдельных митохондриях в астроците слева и нейроне справа.
Наши подходы полезны для визуализации митохондриального кальция in vitro и in vivo для специфического типа клеток. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изобразить поглощение кальция митохондриями в астроцитах и в нейронах.
