Demonstrando o procedimento estarão o estudante de pós-graduação Zhe Zhang, o especialista em pesquisa Nannan Zhang, os professores Illker Ozden e Shinghua Ding. O objetivo geral deste procedimento é desenvolver astrócitos de pares específicos do tipo celular e os neurônios e o método de segmentação mitocondrial para contagens mitocondriais in vitro e in vivo de imagem usando indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP5G e 6s. Para imagens in vitro ou in vivo, construiremos plasmídeos de DNA contendo promotores específicos de astrócitos ou neurônios gfaABC1D ou CaMKII e indicadores de cálcio geneticamente codificados, GCaMP5G/6s com sequências de alvo mitocondrial.
Para imagens de cálcio mitocondrial in vitro, transfeccionamos neurônios de astrócitos cultivados em deslizamentos de tampa de vidro com os plasmídeos de DNA acima mencionados usando o método lipofectamina. A imagem pode ser iniciada de um a dois dias após a transfecção transferindo os deslizamentos de tampa de vidro para a câmara de profusão sob um microscópio de epifluorescência ou dois fótons. Aqui estão exemplos de sinais fluorescentes de mitocôndrias e um astrócito expressando GCaMP6s à esquerda, e para mitocôndrias em um neurônio, expressando GCaMP5G à direita.
Para a imagem in vivo, preparamos o adenovírus associado ao sorotipo 5 para a expressão de mito-GCaMP5G em astrócitos e sorotipo 9 associado adenovírus para expressão de mito-GCaMP6s em neurônios. Para cirurgias de injeção de vírus estereulíticos, primeiro anestesiamos o rato com 3% de isoflurane. Mais tarde, durante a cirurgia, os níveis de isoflurano são reduzidos a 2%Após o nível adequado de anestesia ser atingido, o cabelo sobre o couro cabeludo é raspado e o rato é posicionado em um instrumento cirúrgico estereotax.
Uma pomada oftalmológica é aplicada aos olhos para protegê-los durante a cirurgia. As cirurgias de injeção são realizadas por meio de procedimentos assépticos, incluindo instrumentos estéreis e técnicas assépticas. Os instrumentos cirúrgicos são esterilizados por autoclaving ou por um esterilizador de contas quentes.
Depois que o mouse é montado no estereotax, o couro cabeludo é limpo com betadina e 70% de etanol três vezes. Em seguida, a pele é cortada ao longo do eixo Bregma Lambda e a vertical é feita por uma broca de alta velocidade sobre o local alvo. Neste trabalho, nós visamos o córtex motor ou o paracótex.
Uma seringa Hamilton de calibre 33 carregando um vetor de adenovírus associado é inserida através do buraco no cérebro e vetores são injetados na área alvo. Para a entrega cortical, injetamos a solução do vírus em duas profundidades em várias etapas. Primeiro, inserimos a agulha um milímetro de profundidade no córtex.
Depois de permitir cinco minutos para o cérebro se recuperar, movemos a agulha até 700 micrômetros de profundidade, injetamos 500 nano litros de solução de vírus. Depois que a injeção é concluída, esperamos cinco minutos para permitir que o vírus se difunda no cérebro. E então movemos a agulha para o segundo local de injeção a 300 micrômetros de profundidade.
Aqui, injetamos mais 500 nano litros de solução de vírus. Depois que a injeção é concluída, esperamos por 10 minutos para permitir que o vírus se difundir e então removemos a agulha do cérebro e fechamos o orifício de rebarba com cera óssea ou Kwik-Sil. Finalmente, a pele é suturada com Vetbond e o rato é recuperado em uma almofada de aquecimento antes de ser enviado de volta para a instalação animal.
O mouse estará pronto para uso para imagens in vivo em um mínimo de três semanas, que é o prazo em que a expressão GCaMP amadurece. As cirurgias de implantação de janelas cranianas também são feitas usando condições assépticas descritas para cirurgias de injeção. Os procedimentos cirúrgicos da janela craniana são idênticos aos procedimentos cirúrgicos de injeção até o ponto de exposição do crânio.
Uma vez que o crânio é exposto, quartos de uma craniotomia de 2-3 mm de diâmetro sobre a área injetada pelo vírus são marcados com quatro buracos rasos feitos por uma broca de alta velocidade ligada a um manipulador. Em seguida, a seção do crânio, nos desfiladeiros da craniotomia são diluídas cuidadosamente e lentamente perfurando o osso em torno de um círculo, conectando esses quatro buracos. Uma vez que o crânio nas bordas é fino o suficiente, então o osso é levantado com pinças afiadas e removido.
A dura-máter exposta pode ser removida ou mantida intacta para implantação da janela craniana. Nossa janela craniana consiste em um deslizamento de tampa de vidro de 3-5 milímetros de diâmetro, criando um disco de silicone de cerca de 300 mícrons de espessura no centro. A montagem da janela craniana é realizada colocando-a sobre a craniotomia.
Um pedaço de palito preso a um manipulador é usado para empurrar a janela craniana suavemente para a superfície do cérebro. Em seguida, a borda da janela craniana é selada com uma pequena quantidade de adesivo de silicone Kwik-Sil. Finalmente, a janela craniana é fixada nas bordas do crânio com acrílico dental.
Deve-se dar cuidados para a aplicação do acrílico dentário ligeiramente sobre as bordas da janela craniana para forte ligação. Como muitos outros grupos de pesquisa implementaram no passado, um gel de 1,2% de agarose pode ser usado entre o vidro da tampa e o cérebro como uma alternativa ao disco de silicone. Depois que a janela craniana é instalada com segurança, uma placa de metal é anexada ao crânio.
Esta placa da cabeça será usada para fixar a cabeça do mouse no palco de um microscópio de dois fótons durante as sessões de imagem. A absorção mitocondrial de cálcio em astrócitos pode ser provocada pela aplicação do ATD, enquanto a absorção mitocondrial de cálcio nos neurônios pode ser provocada pela aplicação da glinacina glutamate em fluido espinhal cerebral artificial, com gravidade através de um sistema de perfusão. A absorção de cálcio em mitocôndrias individuais em astrócitos e neurônios pode então ser observada.
Os filmes a seguir mostram a absorção mitocondrial de cálcio em um astrócito provocado por ATP à esquerda e em um neurônio provocado por glutamato e glicina à direita. A imagem é feita coletando imagens in vivo in vivo de dois fótons de sinais fluorescentes mitocondriais em astrócitos e neurônios com um sistema de microscopia de dois fótons Ultima da Prairie Technologies, que é equipado com um milhão de ti safira ultra um laser da Coherent. Usamos os comprimentos de onda de excitação de 880 a 910 nanômetros, que são ideais para imagens in vivo com GCaMP5G e 6s.
Astrócitos e expressão específica de neurônios mito-GCaMP5G e 6s e reconfirmados pela co-localização da rotulagem específica de astrócitos de SR101 ou marcador específico de neurônio NeuN. A absorção espontânea de cálcio mitocondrial em astrócitos e neurônios in vivo pode ser observada por imagens de lapso de tempo usando microscopia de dois fótons. Imagens mostram aumentos espontâneos de cálcio em mitocôndrias individuais em um astrócito à esquerda e um neurônio à direita.
Nossas abordagens são úteis para o tipo celular específico de imagem de cálcio mitocondrial in vitro e in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imaginar a absorção mitocondrial de cálcio em astrócitos e em neurônios.
