培养的星形胶质细胞中线粒体系统的实时成像

该协议极大地最大化了显微镜作为在长采集期内跟踪单个细胞内线粒体动力学的方法的力量。与固定细胞组或一次一个细胞上的延时不同，归一化为每个细胞中每个测量标准的基线控制细胞之间的异质性。通过配备自动化平台和病毒载体的显微镜，我们可以将这种方案用于每种类型的细胞。

首先在多孔培养皿中每平方厘米电镀20， 000至25， 000个细胞，并在含有5%二氧化碳的气氛中以37摄氏度储存，用于实验的其余部分。在体外8天，每细胞加入0.6皮克P24抗原，用于线粒体生物传感器MitoTimer稀释在磷酸盐缓冲盐水中稀释。在体外11天，用预热的无菌PBS进行两次洗涤，并加入不含酚红的新鲜星形胶质细胞培养基。

在使用 LV-G1 MitoTimer 慢病毒感染后至少三到五天评估星形细胞线粒体系统。使用40倍的放大倍率，使用线粒体网络选择每孔五个星形胶质细胞，表达足够水平的LV-G1 MitoTimer。注意选择尽可能平坦和大的星形胶质细胞，而不是位于细胞簇中。

然后使用绿色和红色荧光信号在490纳米处使用顺序激发和红色荧光信号在红色通道上使用550纳米的顺序激发捕获荧光图像，并对每个坐标使用150倍的放大倍率。通过单击ND处理为每个图像序列选择红色和绿色通道的第一帧，然后选择帧。然后，通过选择转化和合并渠道来合并红色和绿色渠道。

若要更正图像底纹，请选择"预处理"，然后选择"自动底纹校正"。通过选择预处理和滚动球来应用滚动球算法。要为每个线粒体生成二进制掩码，请选择分割和阈值。

通过选择二进制处理和触摸边框来删除被边框截断的任何对象。选择测量值，然后选择物体面积、EEQ 直径、长度、宽度、粗糙度、圆度或伸长率，分别测量表面积、直径、长度、宽度、粗糙度、圆度或伸长率。使用这些测量值组成一个组，并将其重命名为 MOFO 数据。

然后选择测量值，然后选择平均强度以测量平均绿色和红色强度。并按比例来衡量红与绿的比率。现在，作曲家对这些测量值进行分组，并将其重命名为比率数据。

最后，通过选择"引用"并将表导出到 CSV 文件，然后将表导出为 CSV 文件，然后通过选择"另存为"来保存 GA 3 分析脚本。通过在 NIS 中打开跟踪模块并选择"查看、分析和跟踪"来开始。单击定义新的 ROI。使用自动检测工具，在图像序列的第一张图像上选择25至50个线粒体，然后单击跟踪自动检测到的ROI分析。

如有必要，请删除不正确的 ROI 轨迹，并将表导出到 CSV 文件。在处理之前手动记录转换测量值。对于每个分析和时间帧，通过参考采集中获得的平均值手动归一化结果数据。

然后使用双向匹配 Nova 执行统计分析。感染LV-G1 MitoTimer的星形胶质细胞的一级培养表现出具有不同碎片水平的平衡和氧化线粒体网络的减少。在过氧化氢处理之前，表达LV-G1 MitoTimer的星形胶质细胞在各种绿色和红色荧光强度下显示出异质线粒体大小。

星形胶质细胞培养物的线粒体形态在与过氧化氢孵育6小时后被分割。在处理后12小时没有直径的情况下，由于球形度减小，它更加明显。关于氧化还原状态和周转，在过氧化氢处理三小时后，星形胶质细胞中绿色线粒体的比例增加。

关于治疗后三小时的动力学和活动性。所有标准都暂时提高了。这种技术适用于许多不同的问题。

例如，在神经退行性疾病的背景下，我们正在研究大脑中分泌的不同分子的雌激素毒性。