在微流体装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

这种相对简单的方法可以帮助研究关注健康和疾病中的运动神经元和神经肌肉接头。该协议使用标准干细胞技术和市售的微流体装置，可提高可重复性。运动神经元和肌肉细胞的断开是几种神经肌肉疾病的早期现象。

一个简单的人性化模型可以帮助制定应对这种现象的策略。我们使用这个模型来研究运动神经元疾病，肌萎缩性侧索硬化症，然而，这个模型也可以用于运动单位至关重要的其他疾病。首先使用镊子将设备从运输容器转移到含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中，以进行灭菌10秒。

将带有镊子的设备转移到一张纸上，在层流中风干约30分钟。干燥设备后，使用镊子将每个设备移动到单独的10厘米培养皿中。要用聚L-鸟氨酸或PLO涂覆设备，向顶部孔中加入100微升PLO溶液，并观察流体从顶部孔通过通道到底部孔。

然后，向底部孔中加入100微升PLO溶液，并在微槽的另一侧重复。最后，在一侧添加100微升PLO溶液，在器件的两个镜面之间形成体积梯度，以涂覆微槽。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三小时。

三小时后，用DPBS清洗设备三次，持续五分钟。按照类似于PLO涂层的程序，用每毫升20微克的层粘连蛋白和神经基质涂覆设备。将设备在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。

第二天使用200微升移液器，将尖端放置在与通道开口相反的孔中，以从孔中除去层粘连蛋白涂层。将DPBS添加到所有孔中后，将带有DPBS的器件留在室温的层流中以进行细胞接种。将单片机切割成设备的大小，同时在每侧留出几毫米。

在含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中对设备和SCM片进行灭菌10秒后，将带有镊子的设备转移到六孔板中，将SCM片转移到10厘米培养皿中，以便在层流中进行空气干燥。将设备放在边缘，让所有侧面干燥约30分钟。通过向六孔板中的每个设备添加每孔一毫升PLO溶液来涂覆设备。

确保设备漂浮在PLO溶液的顶部，通道和微槽侧朝下进入液体。通过将10毫升PLO溶液添加到10厘米培养皿中来涂覆SCM片材，并使用镊子将单片机片推入液体中。如前所述，将设备和 SCM 片材孵育三个小时。

三小时后，用DPBS清洗设备和SCM片材两次，持续五分钟，然后用无菌水再次洗涤五分钟。然后将每张单片机转移到单独的10厘米培养皿中风干。在层流中在显微镜下工作时，使用镊子将硅胶装置与通道和微槽以90度角朝下安装到SCM片上，确保所有侧面对齐。

轻轻按压到设备上，确保不仅密封外边缘，还密封孔、通道和微槽周围。要用层粘连蛋白涂覆设备，在层流内部和显微镜下，使用200微升移液管在顶部孔中加入100微升每毫升20微克的层粘连蛋白溶液。观察从顶部井通过通道到底部井的流体在井和通道周围没有任何泄漏。

随后，向底部孔中加入100微升的层粘连蛋白溶液，在微槽的另一侧重复，并在一侧用额外的100微升层粘连蛋白完成，以在器件的两个镜面之间形成体积梯度以涂覆微槽，然后将器件孵育过夜。第二天，使用200微升移液器将尖端定位在通道开口对面的孔中，从孔中取出涂层，将DPBS添加到所有孔中后，将带有DPBS的设备留在室温的层流中进行细胞接种。要将神经祖细胞或NPC接种在微流体装置中，请使用200微升移液管从装置中微槽一侧的两个孔中取出DPBS。

为了接种总共250， 000个NPC和60至100微升的天10运动神经元培养基，在右上方的孔中，以45度的角度播种靠近通道开口的细胞悬浮液的一半。暂停几秒钟，让细胞悬浮液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬浮液加入下孔中。使用笔将晶种侧标记为NPC或等效物，以便在没有显微镜的情况下轻松定位设备，并孵育五分钟以进行细胞附着。

接下来，用额外的第10天运动神经元培养基缓慢地将两个NPC播种孔充注到每孔200微升的总体积。使用200微升移液器，从与新播种的NPC相对的微槽另一侧的两个孔中取出DPBS。向未播种的孔中加入每孔200微升第10天运动神经元培养基。

然后在设备周围每10厘米培养皿中加入6毫升DPBS，以防止培养基在孵育过程中蒸发。要更换培养基，通过将200微升移液器尖端放置在与通道开口相对的孔壁底部边缘，用NPC缓慢去除两个孔中的培养基。为了防止强培养基流损坏通道上的细胞，通过在顶部和底部孔之间不断变化，向每个孔缓慢添加50至100微升的新鲜运动神经元培养基。

重复该过程，直到每个孔含有200微升培养基。在运动神经元分化的第17天，用200微升移液管除去设备中微沟中未播种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤孔。通过在顶部孔中接种一半的细胞悬浮液，在每个装置的60至100微升生长培养基中播种总共200， 000个人类原发性介观胚层母细胞或MABs。

暂停几秒钟，让细胞悬浮液流过通道，然后将剩余的一半细胞悬浮液接种在底部孔中，如前所述，用于电镀NPC。将设备孵育五分钟以进行细胞附着。然后用额外的生长培养基填充两个新鲜播种的MAB孔，并再次孵育， 如图所示。

为了在运动神经元分化的第21天启动化疗策略和体积梯度，向Myotube室中每孔添加200微升含有生长因子的运动神经元神经基质培养基，然后向运动神经元室中每孔添加100微升无生长因子的运动神经元基础培养基。在微流体装置中共培养细胞系之前，评估细胞系的分化潜力非常重要。测定了MABs的融合指数，估计约8%足以进行共培养。

产生的运动神经元培养物对运动神经元标志物的阳性率为85%至95%。为了表征和量化神经肌肉接头或NMJ的数量，运动神经元和突触前标志物之间的共定位数量神经丝重链和突触后乙炔受体标记α bungartoxin通过每个疾病堆栈计数，并在Z-stack中存在的多个肌球蛋白重链标记Myotubes上归一化。NMJs表现为单一接触点NMJ，其中神经突触碰到一个相互作用点处的微妙胆碱受体簇。

或者作为多接触点NMJ，其中神经突起并在较大的表面上与微妙的胆碱受体簇啮合。对运动神经元创新肌管百分比的量化表明，并非所有肌管都含有NMJ。在用氯化钾激活运动神经元时，在Fluo-4标记的Myotubes中观察到钙流入，这证实了与Myotube中的运动神经元神经突的功能连接，将NMJ阻断剂d-tubocurarine或DTC添加到Myotube室导致钙流入的抑制。

为了使该模型取得最大成功，执行细胞系质量检查并避免在设备通道中形成气泡非常重要。将培养皿中的神经肌肉接头与其他IPC直接细胞类型相结合，可以更好地模拟体外情况，这也允许研究这些细胞类型的作用。