人类神经肌肉接头光遗传学模型的工程和表征

该协议描述了如何设计功能性3D体外人类神经肌肉接头，可用于研究神经肌肉病理学和测试潜在的治疗方法。该技术使用同时进行光遗传学刺激和视频处理。它是在发育过程中以及由于外部因素（例如神经毒素和重症肌无力患者的血清）而引起的神经肌肉接头功能的变化的量化。

涉及肌肉细胞和运动神经元播种到生物反应器中的步骤起初可能具有挑战性。将胶原蛋白凝胶混合物保持在冰上可以帮助延长凝胶凝固之前所有细胞的种子时间。首先将10比1的碱与聚二甲基硅氧烷或PDMS的固化剂混合物混合，然后将混合物放入真空室中。

关闭所有阀门并打开真空，使混合物脱气至少30分钟，直到没有气泡残留。将混合物倒入模具中，并在真空室中对模具进行脱气1小时，然后以正确的方向关闭模具，模具的上半部分。将六角形钢棒放在中心上，并在两侧夹紧。

接下来，用PDMS重新填充顶部，并在65摄氏度的烤箱中固化模具至少4小时。模具冷却到室温后，从模具中取出平台。同时，使玻璃盖在1%非离子表面活性剂多元醇中滑动30分钟，确保盖板不会堆叠并且全部正确涂覆，然后用蒸馏水冲洗干净，并在65摄氏度下干燥过夜。

使用等离子清洗剂处理玻璃盖玻片和 PDMS 平台，每分钟含 6 升氧气，持续 1 至 2 分钟。处理后，通过将PDMS压在盖玻片上至少30秒，将两者粘合在一起。准备每毫升3毫克胶原蛋白1和增溶基底膜基质的4比1混合物，然后将成肌细胞重悬于这种新鲜制备的胶原蛋白混合物中。

接下来，将15微升这种细胞 - 胶原蛋白悬浮液加入生物反应器的每个肌肉室，确保使用移液器尖端将悬浮液分散在两个支柱上。让细胞凝胶混合物在37摄氏度下聚合30分钟，然后用450微升的肌强直生长培养基填充每个生物反应器。在运动神经元分化的第11天，将细胞和培养基转移到50毫升管中，并让神经球沉降到底部5分钟。

吸出上清液并将细胞重悬于15毫升的运动神经元悬浮培养基中，其中补充有每毫升20纳克的脑源性神经营养因子和每毫升10纳克的神经胶质细胞衍生神经营养因子。在分化方案的第14天，将运动神经元播种到平台中。制备每毫升胶原1和增溶基底膜基质2毫克的4比1凝胶混合物。

使用400纳米细胞过滤器选择大的神经球，并将它们重悬于制备的凝胶混合物中。小心地从储液槽和神经球孔中吸取培养基，然后将15微升的凝胶混合物加入神经球通道中。将10微升移液器与10微升凝胶一起装入，然后选择一个神经球。

将神经球沉积到神经球通道中，确保其在腔室中，然后在神经球沉积后缓慢抬起移液器，同时释放剩余的凝胶。让凝胶在37摄氏度下聚合30分钟，然后向储库中添加450微升的NbActiv4，其中补充了每毫升20纳克的脑源性神经营养因子和每毫升10纳克的神经胶质细胞衍生的神经营养因子。对于成像，使用带有科学互补金属氧化物半导体相机软件的倒置荧光显微镜。

将"合并"设置为 2 x 2，将曝光设置为 20 毫秒，打开滚动快门，将读出速率设置为 540 MHz，将动态范围设置为 12 位，将增益设置为 1，并将传感器模式设置为重叠。在显微镜上使用2x物镜对微组织进行成像，并将活细胞室连接到显微镜载物台上。选择包含受支配骨骼组织的感兴趣区域以最小化文件大小和处理时间，然后在样品和成像物镜之间放置一个594纳米长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。

接下来，将包含四个生物反应器的矩形4孔板放入活细胞室中，然后单击实时视图并以所需的ROI居中聚焦图像。从 GitHub 文件夹中下载自定义宏代码以控制舞台位置、Arduino 板和视频采集，然后将输出影片设置为日下划线组织组下划线组织名称下划线实验点 ND2。在舞台上设置所需的 X 和 Y 坐标运行宏代码，并以每秒 50 帧的速度获得 1700 帧的快速延时。

成像后，更换培养基并将样品返回培养箱。在图像采集会话之间至少间隔24小时，以避免组织疲劳。对于电影处理，请从 GitHub 文件夹下载文件，并使用自定义 MATLAB 代码在批量分析中处理视频。

打开递归操作系统分析脚本，将所有获取的视频放在同一文件夹中。调整预分析参数并运行递归OS分析脚本，通过并行处理对电影进行分析。根据需要调整分析后参数，如基线时间、峰值阈值、最小-最小突出度和最小-最小宽度。

最后，通过运行递归OSMovie来生成视频和图形输出，为每个组织生成一个视频文件及其各自的收缩性轨迹。该方案使用两个具有不同规模的系统进行测试，一个微流体装置产生1毫米长的骨骼肌组织，包括大约20， 000个肌母细胞，以及开孔生物反应器系统，产生4毫米长的肌肉组织，包括大约450个肌母细胞。建立了一种光学设置，允许用蓝光控制刺激运动神经元，并且使用自定义显微镜宏观脚本与自定义Arduino代码配对来提升NMJ功能。

该代码包括可调可调参数，并根据光脉冲和收缩峰值开始之间的时间确定是否触发收缩。该系统捕获了组织中NMJ功能的改善，显示组织制造后一周触发的反应增加，随后又稳定了一周的功能。α-蹦高毒素停止了所有触发和自发的收缩，导致NMJ功能完全破坏，表明对组织的光刺激需要功能性NMJ。

用20%重症肌无力血清治疗48小时的组织分析显示，与用健康供体血清治疗的对照组织相比，功能下降。在去除并洗出血清48小时后，工程化的NJ显示出功能恢复。确保所有生物反应器在烘箱中放置的时间相等，以避免批次之间的刚度变化。

此外，请务必使用显微镜验证运动神经元的播种。在此程序之后，可以进行代谢组学，蛋白质组学和CRISPR筛选，以收集更多信息并更好地了解由患病血清引起的机制变化。