이 비교적 간단한 방법은 건강과 질병에 있는 운동 신경 및 신경 근육 접합에 집중하는 연구를 도울 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 줄기 세포 기술과 재현성을 증가 시판되는 미세 유체 장치를 사용합니다. 모터 뉴런과 근육 세포의 단절은 여러 신경 근육 질환의 초기 현상입니다.
단순한 인간화 모델은 이 현상을 대응하기 위한 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 운동 신경 장애, 근위축성 측삭 경화증을 조사하기 위하여 이 모형을 이용합니다, 그러나, 이 모형은 또한 모터 장치가 필수적인 그밖 무질서를 위해 사용될 수 있습니다. 먼저 선적 용기에서 10밀리리터를 함유한 페트리 접시에 10밀리리터를 함유한 페트리 접시로 장치를 10초 동안 살균하는 것으로 시작한다.
집게가 있는 장치를 종이로 옮겨 라미나르 플로우에서 약 30분 동안 공기건조시다. 장치가 건조되면 집게를 사용하여 각 장치를 개별 10센티미터 페트리 접시로 이동합니다. 폴리 L-올니틴 또는 PLO로 장치를 코팅하려면 100 마이크로리터의 PLO 용액을 상단에 잘 추가하고 채널을 통해 상부에서 바닥까지 잘 전달되는 유체를 관찰합니다.
그런 다음, 100 마이크로리터의 PLO 용액을 바닥에 잘 넣고 마이크로 홈의 반대편에서 반복한다. 한쪽에 100 마이크로리터의 PLO 솔루션을 추가하여 마이크로 홈을 코팅하는 장치의 두 미러 사이드 사이에 볼륨 그라데이션을 생성합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3시간 동안 배양합니다.
3시간 후 DPBS로 5분간 세 번 세척합니다. PLO 코팅과 유사한 절차를 따라 밀리리터 라미닌 및 신경 물질 배지당 20 마이크로그램으로 장치를 코팅합니다. 밤새 장치를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
다음 날은 200 마이크로리터 파이펫을 사용하고 우물에서 라미닌 코팅을 제거하기 위해 채널 개구부와 반대되는 우물에 팁을 배치합니다. 모든 우물에 DPBS를 추가한 후, 세포 파종을 위해 실온에서 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다. 양쪽에 몇 밀리미터를 남기면서 SCM 시트를 장치 크기로 잘라냅니다.
10초 동안 70%에서 100%에탄올의 10밀리리터가 포함된 페트리 접시에 장치와 SCM 시트를 살균한 후, 집게가 있는 장치를 6웰 플레이트로 옮기고 SCM 시트는 10센티미터 페트리 접시로 옮겨 라미나르 플로우에서 공기 건조를 위한 것입니다. 장치를 가장자리에 배치하여 모든 면이 약 30 분 동안 건조 할 수 있도록합니다. 6웰 플레이트의 각 장치에 잘 당 PLO 용액 1밀리리터를 추가하여 장치를 코팅합니다.
채널과 마이크로 홈 측이 액체를 아래로 향하여 PLO 용액 위에 장치가 떠 있는지 확인합니다. 10센티미터 페트리 접시에 PLO 용액 10밀리리터를 추가하여 SCM 시트를 코팅하고, 포셉을 사용하여 SCM 시트를 액체로 밀어 넣습니다. 이전에 설명한 대로 3시간 동안 장치 와 SCM 시트를 인큐베이션합니다.
3시간 후, DPBS로 5분간 장치와 SCM 시트를 두 번 세척한 다음 멸균물로 5분간 세척합니다. 그런 다음 각 SCM 시트를 개별 10센티미터 페트리 접시에 공기 건조로 옮기합니다. 라미나르 플로우의 현미경으로 작업하는 동안, 모든 면이 정렬되도록 SCM 시트에 90도 각도로 채널 및 마이크로 홈 측면으로 실리콘 장치를 장착하는 집게를 사용합니다.
장치를 가볍게 눌러 외부 가장자리뿐만 아니라 우물, 채널 및 마이크로 홈 을 밀봉해야합니다. 라미닌으로 장치를 코팅하려면, 라미나르 흐름 내부와 현미경 아래, 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 상단에 잘 상단에 라미닌의 밀리리터 용액 당 20 마이크로 그램의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 우물과 채널 주위에 누출없이 잘 하단에 채널을 통해 잘 상단에서 전달 유체를 관찰.
이어서, 100 마이크로리터의 라미닌 용액을 잘 바닥에 추가하고, 마이크로 홈의 반대편에서 반복하고, 한쪽에 라미닌의 100 마이크로리터를 추가로 마무리하여 장치의 두 미러사이드 사이에 볼륨 그라데이션을 만들어 마이크로 홈을 코팅한 다음 하룻밤 동안 장치를 인큐베이팅한다. 다음 날, 모든 우물에 DPBS를 추가한 후, 채널 개구부 맞은편에 팁을 배치하여 200 마이크로리터 파이펫으로 우물에서 코팅을 제거하고, 세포 파종용 실온에서 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다. 미세 유체 장치에서 신경 전구 세포 또는 NPC를 플레이트하려면 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 장치의 마이크로 홈의 한쪽에 있는 두 개의 우물에서 DPBS를 제거합니다.
장치당 250, 000 NPC 및 60~100마이크로리터를 기기당 10마이크로리터를 시드하기 위해, 오른쪽 상단에 있는 셀 서스펜션의 절반은 45도 각도로 채널 개구부에 가깝다. 셀 서스펜션이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지한 후 나머지 절반은 낮은 셀 서스펜션을 잘 추가합니다. 펜을 사용하여 시드 측을 NPC 또는 동등한 면으로 표시하여 현미경이 없는 장치의 쉬운 방향을 위해, 셀 부착을 위해 5분 동안 배양합니다.
다음으로, 2개의 NPC 시드 우물을 10일 모터 뉴런 배지로 천천히 위로 올려 서 주며, 총 부피200 마이크로리터가 잘 들어섭다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여, 갓 시드 된 NPC반대마이크로 홈의 반대편에있는 두 우물에서 DPBS를 제거.
그런 다음 잠복 하는 동안 매체의 증발을 방지 하기 위해 장치 주위에 10 센티미터 접시 당 DPBS의 6 밀리 리터를 추가 합니다. 매체를 변경하려면 채널 개구부 맞은편 웰 월의 하단 가장자리에 200 마이크로리터 파이펫 팁을 배치하여 NPC를 사용하여 두 우물모두에서 미디어를 천천히 제거합니다. 채널의 세포에 강한 중간 흐름이 손상되는 것을 방지하기 위해, 상하와 하부 사이를 지속적으로 변경하여 각각의 웰에 신선한 모터 뉴런 배지의 50~100 마이크로리터를 천천히 추가합니다.
각 우물에 200 마이크로리터가 들어서면 공정을 반복합니다. 모터 뉴런 분화의 17일째에, 200 마이크로리터 파이펫으로 장치의 마이크로 홈의 시드되지 않은 측의 모터 뉴런 배지를 제거하고 DPBS로 우물을 세척한다. 총 200, 000 인간 1차 중전지 폭발 또는 MABs를 시드하여, 상단의 세포 현탁액의 절반을 잘 시드하여 장치당 60~100마이크로리터의 성장 배지를 시드한다.
세포 현탁액이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지하여 NPC를 도금하기 위해 앞에서 입증된 바와 같이, 하단에 있는 셀 서스펜션의 나머지 절반을 시드하기 전에 채널을 통해 흐르도록 합니다. 그런 다음 두 개의 갓 MAB 시드 우물을 추가 성장 매체로 위로 올려 입증 된 대로 다시 배양하십시오.
운동 뉴런 분화의 21일째에 화학 전술과 체피 그라데이션을 시작하려면, 운동 뉴런 컴파트먼트에 성장 인자를 함유한 운동 뉴런 신경물질 배지의 웰당 200마이크로리터를 추가한 다음, 운동 뉴런 컴파트먼트에 성장 인자 없이 운동 뉴런 기저 배지의 웰당 100마이크로리터를 추가한다. 미세 유체 장치에서 공동 배양하기 전에 세포주의 분화 잠재력을 평가하는 것이 중요합니다. MAB의 융합 지수가 결정되었고, 약 8%가 공동 배양에 충분하다고 추정되었다.
생성된 운동 신경 배양은 운동 신경 마커에 대해 85~95%의 양성이었다. 신경근육 접합체 또는 NMJ의 양을 특성화하고 정량화하기 위해, 운동 뉴런과 시냅틱 마커 간의 공동 국소화 의 수는 신경필라멘트 중체인과 시냅토피신 및 포스트냅틱 아세틸렌 수용체 마커 알파 분가로톡신 사이의 공동 국소화수를 각 질환 스택을 통해 계산되어 내 osin-무거운 사슬의 수로 정상화되었다. NMJs는 단일 접촉 지점 NMJ로 나타났으며, 중성염은 한 상호 작용 지점에서 미묘한 콜린 수용체의 클러스터에 닿았습니다.
또는 뉴라이트가 더 큰 표면 위에 미묘한 콜린 수용체 클러스터와 교전된 다중 컨택포인트 NMJs로. 운동 뉴런의 백분율의 정량화는 모든 Myotubes가 NMJ를 포함하지 않는 것을 나타냈다. 염화칼륨을 통한 운동 뉴런 활성화시, 플루오-4 라벨이 부착된 묘튜브에서 칼슘 유입이 관찰되었으며, 이는 묘튜브의 운동 뉴런 뉴라이트에 대한 기능적 연결을 확인했으며, NMJ 차단제 d-tubocurarine 또는 DTC를 묘튜브 구획에 첨가하여 칼슘 유입을 억제하는 결과를 낳았다.
이 모델로 가장 큰 성공을 거두기 위해 셀라인 품질 검사를 수행하고 장치 채널에서 기포가 형성되는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다. 다른 IPC 직접 세포 유형과 접시에 신경 근육 접합을 결합하면 체외 상황이 더 잘 모방, 이것은 또한 이러한 세포 유형의 역할을 연구 할 수 있습니다.
