检测植物宿主中叶蝉载体的病毒和唾液蛋白

该协议提供了一种检测叶蝉和植物宿主的唾液蛋白的技术，以进一步研究这些蛋白质在植物宿主中的功能。这种技术易于执行，系统稳定且可复制。该方法也有助于检测其他半翅目和植物宿主的唾液蛋白。

首先，在40 x 35 x 20厘米的立方体笼子中饲养稻苗上的成年叶蝉。保持笼子的一侧盖上防虫网，以便通风。将带有叶蝉的笼子放在装有内置湿度控制器的培养箱中，温度为26摄氏度，相对湿度为60%至75%，照相时间为16小时，黑暗时间为8小时。

每周一次，使用吸气器将所有成虫从笼子中轻轻转移到装有新鲜稻苗的新笼子中。允许200多个成年人在水稻中交配和产卵。保留老稻苗，让若虫出苗，并将这些新的非病毒若虫培育到第二龄期。

使用抽吸器，小心地将第二龄非病毒若虫转移到玻璃培养管中一到两个小时以使其饥饿。然后将若虫释放到装有在盆中生长的水稻矮化病毒感染水稻植物的笼子中，让若虫以受感染的水稻植物为食两天。两天后，小心地将这些若虫转移到装有新鲜无病毒水稻幼苗的新笼子中，让若虫以无病毒水稻幼苗为食12天，以完成水稻矮化病毒的循环传播期。

为了收集唾液蛋白，准备五个小管状喂食笼，一端覆盖着防虫网。在每个喂食笼中限制 15 到 20 个叶蝉后，用薄泡沫垫覆盖笼子的另一端。在笼子的末端和用胶带的泡沫垫之间固定一棵稻苗，确保饲养笼中的叶蝉可以以暴露在笼子内部的水稻幼苗为食。

将幼苗根部浸入水中，使水稻植株保持活力，并让叶蝉以它们为食两天。两天后，将叶蝉从饲养笼中取出，收集叶蝉喂养的水稻幼苗。将幼苗切出网箱，恢复幼苗的摄食区。

用800毫升无菌水稀释200毫升制备的5x缓冲液，制备1x Tris-甘氨酸缓冲液。然后准备10x TBS缓冲液，并在121摄氏度下高压灭菌溶液15分钟。接下来，准备4x蛋白质样品缓冲液。

然后通过将800毫升Tris-甘氨酸缓冲液与200毫升甲醇混合来制备转印缓冲液。最后，通过加入 100 毫升 10x TBS 和 3 毫升吐温 20 至 900 毫升无菌水制备 TBST 溶液。为了检测唾液和病毒蛋白，用液氮研磨0.1克大米样品，直到组织变成粉末。

然后将 200 微升 4x 蛋白质样品缓冲液加入样品中并煮沸 10 分钟。离心样品并将上清液转移到新小瓶中。将 10 μL 样品加载到 SDS-PAGE 凝胶上，并在 Tris-甘氨酸缓冲液中以 150 伏电压运行 45 至 60 分钟。

在凝胶电泳时，将0.45微米硝酸纤维素膜和其他三明治用品置于转印缓冲液中30分钟。运行后，夹住凝胶并在转印缓冲液中以 100 伏电压转移 90 至 120 分钟。印迹完成后，将膜置于TBST中的7%脱脂奶粉封闭溶液中，孵育20分钟。

之后，加入针对稻矮病毒P8或卵黄素的抗体，并将膜孵育两小时或过夜。孵育后，用TBST洗涤膜三次，每次洗涤之间孵育五分钟。然后加入山羊抗兔 IgG 作为二抗，并将膜孵育 60 至 90 分钟。

使用ECL蛋白质免疫试剂盒在试剂盒中的混合检测试剂1和2中以1：1的比例进行化学发光检测。将膜放在混合试剂上，孵育印迹膜五分钟。排出多余的试剂，拍摄膜的化学发光和比色图像。

将图片组合起来，看看后者与蛋白质条带。用于检测卵黄原蛋白的蛋白质印迹分析显示，在喂养水稻植物和昆虫的唾液腺中，特异性和预期条带约为220千道尔顿。相比之下，在非摄食植物中没有观察到条带，表明卵黄原蛋白作为唾液蛋白在植物宿主中释放。

用于检测稻矮病毒P8蛋白的蛋白质印迹分析显示，在饲养植物和病毒昆虫体内，特异性和预期条带约为46千道尔顿。相比之下，在非摄食植物和非病毒性叶蝉体中未观察到条带，证明病毒蛋白也可以在摄食植物中检测到。在执行此协议时，应考虑叶蝉中的病毒载量，检测时间和重复。

这种方法也可用于研究传播虫媒病毒的蚊子。