用于 老德法纹 状体唾液采集的双层膜夹层法

人工喂养和唾液收集为检测昆虫唾液中的效应物提供了一种直接的方法。但是，这在以前没有详细描述过。该协议对从腐生昆虫收集唾液有效。

此外，这是一种简单的技术，因为我们使用仅含有蔗糖的培养基作为人造饮食。腐生昆虫的唾液可能会影响宿主的免疫系统，以利于喂养行为并传播病原体。这种药物可用于昆虫行为和昆虫骨路的研究。

这是一种简单的执行方法。然而，这表明正在收集唾液以进行进一步研究，因此需要安装清洁的实验环境。首先为人工饮食制备5%蔗糖溶液，并通过0.22微米过滤器过滤溶液以除去细菌污染和杂质。

将大约200个小的棕色植物料斗幼虫饿死三到五个小时，然后再将它们引入喂食室。接下来，准备玻璃圆筒作为进料室，在引入实验昆虫之前用石蜡膜覆盖腔室的一个开口端，然后将昆虫转移到玻璃圆筒中，并用拉伸的石蜡膜覆盖腔室的另一端。在膜上加入200微升人造饮食，然后用另一层拉伸的石蜡膜覆盖液体。

最后，用铝箔覆盖腔室，使末端的人造饮食装置暴露在光线下。24小时后，通过将圆筒冷却在4摄氏度下以固定昆虫来收集SBPH唾液，然后揭开外膜并使用无菌移液管将人造饮食收集到1.5毫升无菌管中。将收集的唾液保持在零下80摄氏度，直到分析。

接下来，用50微升新鲜人造饮食轻轻移液三次冲洗内膜，并将人工洗涤饮食收集到1.5毫升无菌管中。冲洗三次后，在内膜上加入新鲜的人造饮食，并在顶部放置新鲜拉伸的石蜡膜。最后，通过0.22微米过滤装置过滤收集的样品，以去除微生物和其他污染物。

将集体唾液样品转移到500微升，10千道尔顿离心过滤器中。离心样品。收集上清液并将最终体积提高到100微升。

要测量收集的唾液的浓度，请打开紫外可见分光光度计，并用双蒸馏水冲洗基座三次。按以下顺序在屏幕上选择选项，蛋白质，蛋白质A280。选择类型和一个吸光度单位，等于每毫升一毫克。

然后选中基线校正框，340纳米。接下来，加载两微升5%蔗糖水溶液作为空白，然后触摸屏幕底部的空白。最后，在设定标准后，加载收集的唾液的两微升并记录蛋白质浓度。

当以5%蔗糖为食时，超过80%的SBPH在前四天存活下来。然而，从第五天开始，死亡率迅速上升到40%，在第七天，只有不到一半的SBPH存活下来。SDS页面分析显示，来自RSV感染的SBPH唾液的浓缩唾液样本比5%蔗糖阴性对照含有更多的蛋白质。

在用于检测RSV衣壳蛋白的蛋白质印迹分析中，一种未感染和有毒的昆虫。在毒力样品中成功检测到RSV衣壳蛋白，一种针对LssgMP基因产物设计的抗体在未感染和有毒样品中检测到78千道尔顿蛋白，证明LssgMP是一种唾液蛋白。对不同组织中LssgMP转录本水平的QRT PCR分析表明，唾液腺中的LSSG转录本水平比全身和肠道高20倍，证实了LssgMP在唾液腺中的特异性表达。

在将实验昆虫引入腔室之前，必须使它们挨饿，以确保我们唾液收集的效率。此外，应每24小时收集和更换一次人工培养基，以减少收集样品中的微生物污染。该技术为研究唾液在传播病原体中的功能提供了直接方法。

此外，它还可以帮助研究昆虫病原体宿主的相互作用。