Этот протокол обеспечивает метод обнаружения белков слюны цикадок и растений-хозяев для дальнейшего исследования функции этих белков в растениях-хозяевах. Этот метод прост в исполнении, а система стабильна и воспроизводима. Этот метод также может быть полезен при обнаружении белков слюны других полужесткокрылых и растений-хозяев.
Для начала выращивайте взрослых цикадок на рассаде риса в кубической клетке размером 40 на 35 на 20 сантиметров. Держите одну сторону клетки закрытой сеткой от насекомых для вентиляции. Поместите клетки с цикадками в инкубатор со встроенным регулятором влажности при температуре 26 градусов Цельсия с относительной влажностью от 60 до 75% при периоде фотосъемки 16 часов света и восьми часов темноты.
Раз в неделю используйте аспиратор, чтобы аккуратно перенести всех взрослых особей из клетки в новую клетку со свежими рассадами риса. Позвольте более чем 200 взрослым особям спариваться и откладывать яйца в рис. Сохраните старые проростки риса, чтобы нимфы появились, и вырастите этих новых невирулиферных нимф до стадии второго возраста.
С помощью аспиратора осторожно перенесите второстепенных невирулиферных нимф в стеклянную культуральную трубку на один-два часа для голодания. Затем отпустите нимф в клетку, содержащую зараженное вирусом риса рисовое растение, выращенное в горшке, и позвольте нимфам питаться зараженным рисовым растением в течение двух дней. Через два дня осторожно перенесите этих нимф в новую клетку, содержащую свежие проростки риса без вирусов, и позвольте нимфам питаться проростками риса без вирусов в течение 12 дней, чтобы завершить период циркуляции вируса рисовой карликовости.
Чтобы собрать белки слюны, подготовьте пять небольших трубчатых кормовых клеток, покрытых сеткой от насекомых на одном конце. Поместив от 15 до 20 цикадок в каждую кормовую клетку, накройте другой конец клетки тонким поролоновым ковриком. Закрепите один саженец риса между концом клетки и пенопластовым ковриком с помощью лент, убедившись, что цикадки в кормовой клетке могут питаться рассадой риса, находящейся внутри клетки.
Погрузите корни саженца в воду, чтобы рисовое растение осталось живым, и дайте цикадкам питаться ими в течение двух дней. Через два дня извлеките цикадок из кормовых клеток и соберите рассаду риса, которой кормились цикадки. Вырежьте саженцы за пределами клетки и восстановите места питания рассады.
Приготовьте 1x трис-глициновый буфер, разбавив 200 миллилитров подготовленного 5-кратного буфера 800 миллилитрами стерильной воды. Затем приготовьте 10-кратный буфер TBS и автоклавируйте раствор при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Затем подготовьте 4-кратный буфер для образцов белка.
Затем приготовьте буфер переноса, смешав 800 миллилитров трис-глицинового буфера с 200 миллилитрами метанола. Наконец, приготовьте раствор TBST, добавив 100 миллилитров 10x TBS и три миллилитра Tween от 20 до 900 миллилитров стерильной воды. Чтобы обнаружить слюнные и вирусные белки, измельчите 0,1 грамма образцов риса с жидким азотом до тех пор, пока ткань не превратится в порошок.
Затем добавьте 200 микролитров 4-кратного буфера для образцов белка в образец и кипятите в течение 10 минут. Центрифугируют образцы и переносят надосадочную жидкость в новый флакон. Загрузите 10 микролитров образца в гель SDS-PAGE и запустите его в буфере Tris-Glycine при напряжении 150 вольт в течение 45–60 минут.
Пока гель работает, поместите нитроцеллюлозную мембрану 0,45 микрона и другие сэндвич-материалы в буфер для переноса на 30 минут. После пробежки сэндвичьте гель и перенесите его на 90-120 минут при напряжении 100 вольт в буфер переноса. После завершения блоттинга поместите мембрану в 7%-ный обезжиренный раствор для блокировки сухого молока в TBST и инкубируйте в течение 20 минут.
После этого добавляют антитело против вируса рисового карлика Р8 или вителлогенин и инкубируют мембрану в течение двух часов или в течение ночи. После инкубации промойте мембрану TBST три раза с пятиминутной инкубацией между каждой промывкой. Затем добавьте козий антикроличий IgG в качестве вторичного антитела и инкубируйте мембрану в течение 60-90 минут.
Используйте набор ECL Western для хемилюминесцентного детектирования в смешанных реагентах обнаружения один и два в наборе в соотношении один к одному. Наденьте мембрану на смешанный реагент и инкубируйте кляксу в течение пяти минут. Слейте излишки реагента и сделайте хемилюминесцентный и колориметрический снимок мембраны.
Объедините картинки, чтобы увидеть последние с белковыми полосами. Вестерн-блоттинг для обнаружения вителлогенина показал специфические и ожидаемые полосы примерно в 220 килодальтон в питающихся рисовых растениях и слюнных железах насекомых. Напротив, у растений, не питающихся, полосы не наблюдалось, что указывает на то, что вителлогенин высвобождался в растении-хозяине в виде белка слюны.
Вестерн-блоттинг для обнаружения белка P8 вируса карликового риса показал специфическую и ожидаемую полосу примерно в 46 килодальтон в питающихся растениях и вирулентных телах насекомых. Напротив, полоса не наблюдалась у непитающихся растений и невирулиферных тел цикадки, что доказывает, что вирусные белки также могут быть обнаружены в питающихся растениях. При выполнении этого протокола следует учитывать вирусную нагрузку в цикадках, время обнаружения и репликации.
Этот метод также может быть применен для изучения комаров, передающих арбовирусы.
