このプロトコルは、ヨコバイおよび植物宿主の唾液タンパク質を検出して、植物宿主におけるこれらのタンパク質の機能をさらに調査するための技術を提供する。この手法は簡単に実行でき、システムは安定していて複製可能です。この方法は、他の半翅目や植物宿主の唾液タンパク質の検出にも役立つ可能性があります。
まず、40 x 35 x 20センチメートルの立方体のケージで、成虫のヨコバイを稲の苗で育てます。ケージの片側を防虫ネットで覆って換気してください。ヨコバイと一緒にケージを、摂氏26度、相対湿度60〜75%の湿度コントローラーが内蔵されているインキュベーターに入れ、16時間の明暗の写真撮影期間の下に置きます。
週に一度、吸引器を使用して、すべての大人をケージから新鮮な米の苗が入った新しいケージにそっと移します。200人以上の成虫が交尾し、米に卵を産むことができます。幼虫が出現するために古いイネの苗を保持し、これらの新しい非ウイルス性の幼虫を2齢期に育てます。
吸引器を使用して、2齢の非ウイルス性ニンフをガラス培養チューブに1〜2時間慎重に移して飢餓状態にします。次に、ポットで育てたイネ矮性ウイルスに感染したイネを含むケージにニンフを放し、ニンフに感染したイネを2日間食べさせます。2日後、これらのニンフを新鮮なウイルスフリーのイネ苗を含む新しいケージに注意深く移し、ニンフにウイルスのないイネ苗を12日間食べさせて、イネ矮性ウイルスの循環伝播期間を完了します。
唾液タンパク質を採取するには、一端に防虫ネットで覆われた小さなパイプ状の給餌ケージを5つ用意します。各給餌ケージに15〜20匹のヨコバイを閉じ込めた後、ケージのもう一方の端を薄いフォームマットで覆います。ケージの端とフォームマットの間に1本の稲苗をテープで固定し、給餌ケージ内のヨコバイがケージの内部に露出したイネの苗を食べられるようにします。
稲が生き続けるように苗の根を水に浸し、ヨコバイが2日間それらを食べられるようにします。2日後、ヨコバイを給餌ケージから取り出し、ヨコバイが餌を与えた稲の苗を集めます。ケージの外側で苗を切り、苗の餌場を回復します。
調製した5xバッファー200ミリリットルを800ミリリットルの滅菌水で希釈して、1xトリス-グリシンバッファーを調製します。次に、10x TBSバッファーを調製し、溶液を摂氏121度で15分間オートクレーブします。次に、4xタンパク質サンプルバッファーを調製します。
次に、800ミリリットルのトリスグリシン緩衝液を200ミリリットルのメタノールと混合して転写緩衝液を調製します。最後に、100ミリリットルの10x TBSと3ミリリットルのトゥイーン20〜900ミリリットルの滅菌水を加えてTBST溶液を調製します。唾液およびウイルスタンパク質を検出するには、組織が粉末になるまで0.1グラムの米サンプルを液体窒素で粉砕します。
次に、200マイクロリットルの4xタンパク質サンプルバッファーをサンプルに加え、10分間煮沸します。サンプルを遠心分離し、上清を新しいバイアルに移します。10マイクロリットルのサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、トリスグリシンバッファー中で150ボルトで45〜60分間実行します。
ゲルの運転中に、0.45ミクロンのニトロセルロースメンブレンとその他のサンドイッチ用品を転写バッファーに30分間入れます。実行後、ゲルをサンドイッチし、転写バッファーに100ボルトで90〜120分間移します。ブロッティングが完了したら、TBST中の7%脱脂粉乳ブロッキング溶液にメンブレンを入れ、20分間インキュベートします。
その後、イネ矮性ウイルスP8またはビテロゲニンに対する抗体を加え、膜を2時間または一晩インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンをTBSTで3回洗浄し、各洗浄の間に5分間インキュベーションします。次に、二次抗体としてヤギ抗ウサギIgGを追加し、メンブレンを60〜90分間インキュベートします。
ECL Western キットは、キット内の混合検出試薬 1 と 2 の化学発光検出に 1 対 1 の比率で使用します。メンブレンを混合試薬の上に置き、ブロットを5分間インキュベートします。余分な試薬を排出し、膜の化学発光および比色写真を撮ります。
写真を組み合わせて、後者をタンパク質バンドで確認します。ビテロゲニンを検出するためのウェスタンブロット分析は、イネの摂食および昆虫の唾液腺において約220キロダルトンの特異的で予想されるバンドを示した。対照的に、非摂食植物ではバンドは観察されず、ビテロゲニンが唾液タンパク質として植物宿主に放出されたことを示しています。
イネ矮性ウイルスP8タンパク質の検出のためのウェスタンブロット分析は、摂食植物およびウイルス性昆虫体において約46キロダルトンの特異的で予想されるバンドを示した。対照的に、非摂食植物および非ウイルス性ヨコバイ体ではバンドは観察されず、ウイルスタンパク質は摂食植物でも検出できることが証明されました。ヨコバイ内のウイルス負荷、検出タイミング、および複製は、このプロトコルを実行する際に考慮に入れる必要があります。
この方法は、アルボウイルスを感染させる蚊の研究にも適用できます。
