非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的 3D 成像

NASH是世界上最重要的慢性肝病之一。它可以进展为纤维化，肝硬化，最终发展为肝癌。研究NASH中ECM的动态变化有助于更好地了解纤维化。

传统的影像学无法显示3D ECM结构变化，限制了对肝纤维化动态ECM重塑过程的理解。首先，在手术前称量鼠标。麻醉后，小鼠使用理发器剃除腹侧区域，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。

将鼠标放在其背上，并用胶带将腿固定在手术板上。使用妙佑医疗国际剪刀和 Adson 镊子在下腹部横向切开 3 厘米的切口。然后从低腹部垂直切开五厘米的切口到剑突，而不打开胸腔。

打开腹膜后，轻轻地将肠道放在动物的左侧，并用人造丝尖端涂抹器抬高肝脏的右叶以暴露门静脉。要对门静脉进行导管插入，将 24 号静脉导管诱导至门静脉远端。在门静脉分支到肝叶之前放置导管尖端。

当导管进入静脉时立即拔出针头。使用一毫升注射器通过导管将 PBS 灌注肝脏，检查导管是否正确放置在静脉内。使用 Dumont 微型镊子、Castroviejo 微针和 4-0 缝合线在门静脉分支下方放置一针，在下方 1 厘米处放置第二针以固定导管。

使用诱饵连接器将导管连接到一米长、三毫米内径和 4.1 毫米外径的硅胶管上。将硅胶管连接到蠕动泵和装有去离子水的储液罐。小心去除管内的气泡，避免在灌注过程中产生新的气泡。

将蠕动泵设置为每分钟 0.2 毫升的流量输出。首先用去离子水细读两个小时，灌注时肝脏的颜色会从红色变为黄色。将灌注溶液换成0.5%脱氧胆酸钠并持续过夜，灌注结束时肝脏将变白。

将灌注溶液换成去离子水并灌注两个小时。使用Dumont微型镊子和微型弹簧剪刀收集脱细胞肝脏，并在带有PBS的培养皿中仔细清洗。将一小块脱细胞肝脏转移到显微镜载玻片上，并将组织放在中间。

用移液管向组织中加入10微升抗淬灭封片剂，以避免纸巾干燥。用盖玻片覆盖组织，并施加小力使样品变平。用无色透明的指甲油密封盖玻片的边缘。

将一滴浸油滴在盖玻片的顶部，然后将载玻片放在显微镜载玻片支架上。降低20X油物镜，直到其接触浸油。切换到波长为 405 纳米的紫色通道。

打开快门并对焦样品。导航并定位感兴趣的区域以进行成像。在使用激光进行图像采集之前关闭快门。

要启动双光子激光器，请切换到计算机控制并首先打开双光子激光器。然后打开双光子激光控制器和快门，确保输出功率高于2.5瓦。降低激光功率以防止荧光淬灭。

选择并调整光电倍增管和混合检测器，以适应所选的荧光团。选择同步或顺序图像采集。将针孔调整到最大值。

调整激光波长、增益、功率、偏移像素停留时间、像素大小平均和变焦。滚动计算机 Z 控制器并设置 Z 尺寸。定义开始和终点，并选择卷内给定的图像数量。

获取图像。在进行两次光子显微镜检查后，未脱细胞的胶原纤维显示出胶原网络的低分辨率图像。在去细胞化细胞外基质中，食物肝脏和快餐食肝脏的形态和空间分布存在明显差异。

胶原纤维和食物饮食的小鼠表现出交织和组织良好的网络，而快餐饮食的小鼠表现出连接较少的胶原蛋白束。肝脏细胞外基质的三维结构表明，食物饮食小鼠的胶原纤维显示出组织良好的网络，但在快餐饮食小鼠中则不然。为了确认去细胞外基质中原纤维胶原蛋白的质量，用苏木精伊红和皮克罗西里乌斯红染色载玻片。

苏木精和伊红显示所有细胞已被去除。在Picrosirius红色染色图像中，来自食物喂养小鼠的细胞外基质揭示了一个组织良好的网络。相比之下，快餐饮食的小鼠表现出更致密的胶原纤维。

灌注前小心地去除管内的气泡。气泡会阻塞肝脏中的血管并影响灌注。