NASH dünyadaki en önemli kronik karaciğer hastalıklarından biridir. Fibroz, siroz ve sonunda karaciğer kanserine ilerleyebilir. NASH'daki ECM'nin dinamik değişimini incelemek, fibrozisi daha iyi anlamaya yardımcı olabilir.
Geleneksel görüntüleme yöntemi, karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenme sürecinin anlaşılmasını sınırlayan 3D ECM yapı değişikliklerini gösteremez. Başlamak için, işlemden önce fareyi tartın. Anestezi uyguladıktan sonra, fare ventral bölgeyi bir saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin.
Fareyi sırtına yerleştirin ve ameliyat tahtasındaki bacakları bantla hareketsiz hale getirin. Alt karın bölgesinde lateral olarak üç santimetrelik bir kesi yapmak için Mayo makası ve Adson forseps kullanın. Ve sonra göğüs boşluğunu açmadan alt karından ksifoid sürece dikey olarak beş santimetrelik bir kesi.
Peritonu açtıktan sonra, bağırsakları yavaşça hayvanın soluna yerleştirin ve portal damarı açığa çıkarmak için karaciğerin sağ lobunu bir rayon uçlu aplikatör ile yükseltin. Portal veni kateterize etmek için, portal venin distal ucuna 24 gauge IV kateter indükleyin. Kateter ucunu portal ven dalları hepatik loblara dallanmadan önce yerleştirin.
Kateter damara girdiğinde iğneyi hemen çekin. Kateter yoluyla bir mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğeri PBS ile perfüze ederek kateterin damar içine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin. Portal venin dallanmasının altına bir dikiş ve kateteri sabitlemek için bir santimetre aşağıya ikinci bir dikiş yerleştirmek için Dumont mikro forseps, bir Castroviejo mikro iğnesi ve 4-0 sütür kullanın.
Kateteri bir metre uzunluğunda, üç milimetre iç çapa ve 4,1 milimetre dış çapa sahip bir silikon boruya bir cazibe konektörü ile bağlayın. Silikon boruyu peristaltik bir pompaya ve deiyonize su içeren bir rezervuara bağlayın. Tüpün içindeki hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın ve perfüzyon sırasında yeni kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
Peristaltik pompayı dakikada 0,2 mililitre akış çıkışına ayarlayın. İlk önce iki saat boyunca deiyonize su ile inceleyin ve karaciğerin rengi perfüzyon sırasında kırmızıdan sarıya değişecektir. Perfüzyon çözeltisini% 0.5 sodyum deoksikolata değiştirin ve gece boyunca devam edin ve karaciğer perfüzyonun sonunda beyazlaşacaktır.
Perfüzyon çözeltisini deiyonize suya geçirin ve iki saat boyunca perfüze edin. Hücreden arındırılmış karaciğeri toplamak için Dumont mikro forseps ve mikro yaylı makas kullanın ve PBS ile bir Petri kabında dikkatlice yıkayın. Küçük bir desellülarize karaciğer parçasını mikroskop slaytına aktarın ve dokuyu ortasına yerleştirin.
Dokunun kurumasını önlemek için pipetle dokuya 10 mikrolitre antifade montaj ortamı ekleyin. Dokuyu bir kapak camıyla örtün ve numuneyi düzleştirmek için küçük bir kuvvet uygulayın. Kapak camının kenarlarını renksiz ve şeffaf oje ile kapatın.
Kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve slaytı mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin. 20X yağ objektif lensini, daldırma yağına temas edene kadar indirin. 405 nanometre dalga boyundaki mor kanala geçin.
Deklanşörü açın ve örneğe odaklanın. Görüntüleme için ilgi alanında gezinin ve konumlandırın. Lazer ışığını kullanarak görüntü yakalamaya geçmeden önce deklanşörü kapatın.
İki foton lazeri başlatmak için, bilgisayar kontrolüne geçin ve önce iki foton lazeri açın. Ardından, çıkış gücünün 2,5 watt'tan yüksek olmasını sağlamak için iki foton lazer kontrol cihazını ve deklanşörü açın. Floresan söndürmeyi önlemek için lazer gücünü azaltın.
Seçilen floroforları barındırmak için hem fotoğraf çarpanlarını hem de hibrid dedektörleri seçin ve ayarlayın. Eşzamanlı veya sıralı görüntü alımlarını seçin. İğne deliğini en yüksek değere ayarlayın.
Lazer dalga boylarını, kazancı, gücü ayarlayın, piksel bekleme süresini, piksel boyutu ortalamasını ve yakınlaştırmayı ayarlayın. Bilgisayar Z denetleyicisini kaydırın ve Z boyutlarını ayarlayın. Başlangıç ve uç noktaları tanımlayın ve bir birim içinde verilen görüntü sayısını seçin.
Görüntüleri alın. İki foton mikroskobu yapıldıktan sonra, desellülarizasyon olmadan kollajen lifleri, kollajen ağının düşük çözünürlüklü bir görüntüsünü ortaya çıkardı. Desellülarize hücre dışı matrikste, chow ve fast food diyet karaciğerleri arasındaki morfoloji ve mekansal dağılımda belirgin farklılıklar gözlendi.
Bir chow diyetindeki kollajen lifleri ve fareler iç içe geçmiş ve iyi organize edilmiş bir ağ sergilerken, fast food diyetindeki fareler daha az bağlantıya sahip kollajen demetleri gösterdi. Karaciğer hücre dışı matrisinin üç boyutlu yapısı, chow diyetindeki farelerdeki kollajen liflerinin iyi organize edilmiş bir ağ gösterdiğini, ancak fast food diyet farelerinde olmadığını göstermektedir. Desellülarize hücre dışı matriksteki fibriller kollajenin kalitesini doğrulamak için, slaytlar Hematoksilin Eozin ve Picrosirius kırmızısı ile boyandı.
Hematoksilin ve Eozin tüm hücrelerin çıkarıldığını göstermektedir. Picrosirius kırmızı boyama görüntülerinde, chow beslenen farelerden gelen hücre dışı matris, iyi organize edilmiş bir ağ ortaya çıkardı. Buna karşılık, fast food diyetindeki fareler daha yoğun kollajen lifleri gösterdi.
Perfüzyondan önce bir tüpün içindeki kabarcığı dikkatlice çıkarın. Kabarcık karaciğerdeki damarı tıkayacak ve perfüzyonu etkileyecektir.
