La NASH è una delle più importanti malattie croniche del fegato al mondo. Può progredire in fibrosi, cirrosi e, infine, il cancro al fegato. Studiare il cambiamento dinamico della ECM nella NASH può aiutare a comprendere meglio la fibrosi.
L'imaging tradizionale non può dimostrare cambiamenti nella struttura della ECM 3D, limitando la comprensione del processo di rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica. Per iniziare, pesare il mouse prima della procedura. Dopo l'anestetizzazione, il topo rade l'area ventrale usando un tagliacapelli e disinfettare la pelle con etanolo al 70%.
Posizionare il mouse sulla schiena e immobilizzare le gambe sulla scheda chirurgica con del nastro adesivo. Usa le forbici Mayo e la pinza Adson per fare un'incisione di tre centimetri lateralmente nell'addome inferiore. E poi un'incisione di cinque centimetri verticalmente dall'addome basso al processo xifoideo senza aprire la cavità toracica.
Dopo aver aperto il peritoneo, posizionare delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale e sollevare il lobo destro del fegato con un applicatore con punta di rayon per esporre la vena porta. Per cateterizzare la vena porta, indurre un catetere IV di gauge 24 nell'estremità distale della vena porta. Posizionare la punta del catetere prima che la vena porta si dirama nei lobi epatici.
Prelevare immediatamente l'ago quando il catetere entra nella vena. Controllare che il catetere sia posizionato correttamente all'interno della vena perfondendo il fegato con PBS utilizzando una siringa da un millilitro attraverso il catetere. Utilizzare una pinza Dumont micro, un microago Castroviejo e una sutura 4-0 per posizionare un punto sotto la ramificazione della vena porta e un secondo punto un centimetro sotto per fissare il catetere.
Collegare il catetere a un tubo di silicone di un metro di lunghezza, tre millimetri di diametro interno e 4,1 millimetri di diametro esterno con un connettore esca. Collegare il tubo in silicone a una pompa peristaltica e un serbatoio contenente acqua deionizzata. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria all'interno del tubo ed evitare di generare nuove bolle durante la perfusione.
Impostare la pompa peristaltica su una portata di 0,2 millilitri al minuto. Esaminare prima con acqua deionizzata per due ore e il colore del fegato cambierà da rosso a giallo durante la perfusione. Passare la soluzione di perfusione allo 0,5% desossicolato di sodio e continuare durante la notte e il fegato diventerà bianco alla fine della perfusione.
Passare la soluzione di perfusione in acqua deionizzata e perfondere per due ore. Utilizzare le micro pinze Dumont e le micro forbici a molla per raccogliere il fegato decellularizzato e lavarlo accuratamente in una capsula di Petri con PBS. Trasferire un piccolo pezzo di fegato decellularizzato su un vetrino da microscopio e posizionare il tessuto nel mezzo.
Aggiungere 10 microlitri di mezzo di montaggio antisbiadimento al tessuto con una pipetta per evitare l'essiccazione del tessuto. Coprire il tessuto con un vetro di copertura e applicare una piccola forza per appiattire il campione. Sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto incolore e trasparente.
Posizionare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio. Abbassare l'obiettivo dell'olio 20X fino a quando non entra in contatto con l'olio ad immersione. Passare al canale viola di lunghezza d'onda 405 nanometri.
Accendere l'otturatore e mettere a fuoco il campione. Naviga e posiziona l'area di interesse per l'imaging. Spegnere l'otturatore prima di passare all'acquisizione delle immagini utilizzando la luce laser.
Per avviare il laser a due fotoni, passare al controllo del computer e accendere prima il laser a due fotoni. Quindi accendere il controller laser a due fotoni e l'otturatore assicurandosi che la potenza di uscita sia superiore a 2,5 watt. Ridurre la potenza del laser per prevenire la tempra a fluorescenza.
Selezionare e regolare i rilevatori sia i moltiplicatori fotografici che l'ibrido per adattarsi ai fluorofori scelti. Scegli acquisizioni di immagini simultanee o sequenziali. Regolate il foro stenopeico sul valore più alto.
Regola le lunghezze d'onda del laser, il guadagno, la potenza, l'offset del tempo di permanenza dei pixel, la media delle dimensioni dei pixel e lo zoom. Scorrere il controller Z del computer e impostare le dimensioni Z. Definisci l'inizio e gli estremi e scegli il numero di immagini fornite all'interno di un volume.
Acquisire immagini. Dopo aver eseguito la microscopia a due fotoni, le fibre di collagene senza decellularizzazione hanno rivelato un'immagine a bassa risoluzione della rete di collagene. Nella matrice extracellulare decellularizzata, sono state osservate differenze apparenti nella morfologia e nella distribuzione spaziale tra fegati di dieta chow e fast food.
Le fibre di collagene e i topi su una dieta chow hanno mostrato una rete intrecciata e ben organizzata, mentre i topi sulla dieta fast food hanno mostrato fasci di collagene con meno connettività. La struttura tridimensionale della matrice extracellulare del fegato mostra che le fibre di collagene nei topi sulla dieta chow hanno mostrato una rete ben organizzata, ma non nei topi dietetici fast food. Per confermare la qualità del collagene fibrillare nella matrice extracellulare decellularizzata, i vetrini sono stati colorati con Eosina ematossilina e rosso Picrosirius.
L'ematossilina e l'eosina mostrano che tutte le cellule sono state rimosse. Nelle immagini della colorazione rossa di Picrosirius, la matrice extracellulare dei topi alimentati con chow ha rivelato una rete ben organizzata. E al contrario, i topi con dieta fast food hanno mostrato fibre di collagene più dense.
Rimuovere con attenzione la bolla all'interno di un tubo prima della perfusione. La bolla bloccherà la nave nel fegato e influenzerà la perfusione.
