收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对代谢物产生的影响

该协议描述了如何在非靶向代谢组学分析时评估异生素对苜蓿的影响。该技术非常简单，操作方便，可以识别更多类型的根系渗出物。这有助于构建植物根系分泌物的代谢组学指纹图谱。

开始药用0.1%次氯酸钠冲洗种子10分钟，开始药用苜蓿或苜蓿种子的灭菌。然后用75%乙醇洗涤30分钟。接下来，用蒸馏水冲洗灭菌的种子几次。

然后在放置在无菌培养皿中的潮湿滤纸上发芽。在黑暗中处于30摄氏度。发芽后，将20个均匀发芽的大丰满种子转移到装满营养液的培养瓶中的植入篮中。

将所有培养瓶放入具有受控条件的生长室中。两周后，将15株均匀的苜蓿幼苗转移到一个新的玻璃瓶中，将它们暴露于每公斤1毫克和每公斤10毫克的DEHP压力下进行培养实验。用铝箔和封口膜包裹处理和控制玻璃瓶，以防止DEHP的光解和挥发。

每天补充营养液以维持液位。每两天随机放置和旋转瓶子，以确保苜蓿幼苗的生长条件一致。栽培七天后，从瓶子中取出苜蓿幼苗。

并用超纯水清洗几次，为收集根系分泌物做准备。通过将10个均匀的苜蓿幼苗转移到装有50毫升灭菌去离子水的离心管中，开始根系渗出物收集实验。要收集根系分泌物，请将管子直立六小时，根部浸入水中。

完成后，用铝箔包裹离心管以保护根部免受光照。取出植物并冷冻干燥收集的液体以进行代谢物分析。通过在冷冻干燥的样品中加入1.8毫升提取溶液来进行提取实验。

涡旋30秒。接下来，在冰水浴中将超声波施加到管子上10分钟。在离心样品之前。

小心地将200微升上清液转移到1.5毫升微量离心管中。从离心管中吸出45微升上清液，并将其混合到质量控制或QC样品中，最终体积为270微升。完成后，在真空浓缩器中冷冻干燥提取物。

干燥完成后，加入五微升内标核糖核酸酶并继续干燥。蒸发后，加入30微升甲氧基胺化盐酸盐溶液，将试管在80摄氏度下孵育30分钟。接下来，向样品中加入40微升BSTFA试剂，然后将试管置于70摄氏度下1.5小时以进行衍生化。

孵育结束并且衍生化样品达到室温后，向衍生化样品中加入五微升溶解在氯仿中的脂肪酸甲酯。使用尺寸为 30 米 x 250 微米 x 0.25 微米的毛细管柱，以每分钟 1.0 毫升的流速用载气氦气分离 1 微升根分泌物。将注射温度设置为280摄氏度。

并将传输线温度保持在280摄氏度。设置用于分离的烤箱程序。分离提取物后，以电子碰撞模式进行质谱分析，能量为负70电子伏特。

将离子源温度保持在250摄氏度。使用全扫描监测模式获得质谱，质量扫描范围为50至500质量，以每秒12.5个谱图的速率。在对照样品的色谱仪中检测到778个峰。

其中314种代谢物根据质谱鉴定。酸进一步细分为脂肪酸、氨基酸、有机酸和酚酸。此外，在苜蓿根系分泌物中也检测到一些通常存在于根系分泌物中的常见物质，包括嘧啶类、羟基嘧啶类、类黄酮类、酚类、酮类、嘧啶类和二萜类。

根据VIP评分绘制热图，以可视化不同DEHP处理中差异代谢物的变化。与对照样品相比，DEHP暴露显著改变了50种代谢物和苜蓿根系分泌物的含量。主要包括一些碳水化合物和低分子量有机酸。

代谢途径分析表明，DEHP显著抑制了作为光合作用产物的碳水化合物的代谢，表明DEHP可以在一定程度上抑制苜蓿的光合作用，DEHP被认为可以促进脂肪酸的代谢，有助于抵抗DEHP的压力。至少应为每次处理进行种子根系渗出物，以确保准确的代谢组学数据分析。我们可以确定差异代谢，并进一步研究污染物环境行为中的重要规则。

植物与更广泛的野外生物群落之间的相互作用可以通过这种方法来破译。