原发性患者特异性主动脉平滑肌细胞的分离和体外半定量实时收缩测量

这种方法允许研究人员同时研究多个患者细胞系的细胞收缩。它使我们能够更快，更有效地研究疾病。这种技术使我们能够实时量化细胞收缩。

在一小时内，我们可以获得数十个单元格的收缩值。我们首次证明，在一组主动脉瘤患者中，肌肉细胞收缩减少。这可能是一种新的生物标志物或药物治疗的靶点。

首先对两对手术镊子和手术刀进行消毒，将它们浸入70%乙醇中，然后将其擦干。然后在培养皿中移液两毫升SMC培养基，其中将进行组织解剖。接下来将2.5毫升SMC培养基移液到两个T-25烧瓶中。

旋转烧瓶，使少量的培养基覆盖整个表面。目视检查活检，通过内膜侧存在动脉粥样硬化斑块和外侧存在粘稠结缔组织来识别三个主动脉层，以区分这些层。为了从培养基中分离SMC，首先将具有内膜斑块的组织侧朝上放置，然后通过用镊子将其从组织中拉出来除去固体斑块，同时用第二对镊子向下推组织，直到粉红色均匀的内侧层可见。

现在翻转组织并通过拉下外膜层重复相同的过程，确保根据需要多次尝试移除所有可见部分，因为该层不会轻易从介质中分离。一旦介质层被分离，通过用镊子将培养基压下，然后将组织切成立方体，并使用手术刀在一个方向上切割组织，使清洁的单向切割以尽量减少损伤。使用镊子将10至20个这些组织碎片放在T-25弹片的上四分之一处。

如前所述，在对两对手术镊子和手术刀进行灭菌后，在培养皿中移液两毫升成纤维细胞培养基，其中将进行组织解剖。然后将2.5毫升成纤维细胞培养基移液到两个T-25烧瓶中，并旋转烧瓶，使少量培养基覆盖整个表面。目视检查活检以识别具有可识别皮肤表面的表皮，有时具有可见的头发，然后在另一侧寻找黄色和粘稠的皮下脂肪。

表皮和皮下脂肪之间的层是真皮，是活成纤维细胞的来源。为了从真皮层中分离成纤维细胞，通过将组织放在真皮层一侧来去除其他两层，以使所有三层都可见。然后用镊子按住组织，并在一条干净的线上切除整个表皮，而不会损坏组织。

现在翻转组织并重复相同的过程，方法是在与皮下脂肪平行的真皮内切割。一旦真皮被分离，将组织切成立方体，用镊子将组织压下，然后使用手术刀将组织切成一个方向。然后使用镊子将10至20个这些组织片放入T-25烧瓶的上四分之一。

使用自动细胞计数器计数细胞，并在明胶包被的ECIS板中以每孔30， 000个细胞的接种密度在200微升SMC培养基中一式三份接种SMC。将板与SMC一起放入细胞培养箱中的ECIS的96孔支架中。双击 ECIS 应用生物物理学软件以打开程序，然后按“设置”按钮。

检查所有电极是否都与左侧下面板中标有“孔配置”的支架接触。如果电极连接不正确，请在开始测量之前调整支架中的板。现在，通过单击阵列类型在同一面板中选择板类型。

接下来，准备两个液管，设置为两微升和150微升体积。在开始刺激之前，按软件中的标记并发表评论。为了刺激细胞，取下盖子并将其放在培养箱内的无菌表面上。

然后通过将两微升的离子霉素工作溶液移液到每个孔中来诱导SMC收缩。一旦所有细胞都受到刺激，使用第二个移液管在孔中混合培养基。为了确定实验间测量的再现性，将所有纳入的对照和患者细胞系的两个独立测量绘制为Bland-Altman图，证明该方法除了一个异常值细胞系外，没有显示出置信区间外的变异性。

用同一实验播种并同时刺激的两个孔显示出几乎相同的契约反应曲线。为了验证所显示的反应是否由于离子霉素刺激而收缩而不是渗透应激，在刺激后更换培养基并记录细胞的行为，这表明受刺激的细胞再次开始在电极上扩散。来自健康、非扩张主动脉的SMC的收缩反应显示中位反应为61%，而腹主动脉瘤患者的中位反应为52%。

对照组的平均收缩反应用于识别4名收缩值低于正常值的患者。蛋白质印迹分析和随后的定量证实细胞表达SMC标志物。为了确定SMC的增殖能力，对Ki67进行了qPCR。

Ki67表达在所有细胞中均可检测到，但与收缩输出不相关。当刺激细胞收缩时，请记住不要同时移液过多的孔，并尽量尽快移液。此过程可能需要一些练习。

使用这种方法，我们根据患者的收缩和降低正常收缩来划分患者，这使我们能够研究这些患者及其临床特征（如吸烟）的联系。