分离人原代瓣膜细胞进行体外疾病建模

分离人原代瓣膜内皮和间质细胞对于了解钙化性主动脉瓣疾病发病机制的潜在机制至关重要。当瓣膜从天然组织中切除时，细胞活力下降。因此，我们确定了一种延长细胞活力的方法。

收到提取的瓣膜组织样本后，提取主动脉根部并将组织浸入含有无菌冲洗溶液的50毫升锥形管中。在摇臂上的冰桶中孵育10分钟后，用70%乙醇喷洒试管。在无菌组织培养罩中，将组织转移到培养皿中并切除两个瓣膜小叶。

将一张小册子放入低温小瓶中，并在液氮中快速冷冻组织以零下80摄氏度储存。为了固定组织以进行钙含量染色，将第二张小叶从结节切成两半到铰链，并将两个组织碎片放入浸没在4%多聚甲醛中的盒中。然后将整个设置在室温下放在摇杆上至少两个小时但不超过四个小时。

为了分离瓣膜间质细胞，将小叶转移到含有冰冷PBS的新50毫升锥形管中，并在室温下将管放在摇杆上两分钟。混合后，将组织转移到含有5至7毫升冷胶原酶溶液的60毫米培养皿中。使用镊子将小叶的两侧浸入溶液中三到四次，然后将组织在细胞培养箱中以 37 摄氏度孵育 5 到 10 分钟，每两分钟轻轻摇动组织 3 到 4 次。

在孵育结束时，将两毫升溶液从培养皿转移到无菌的15毫升锥形管中。将镊子放在小叶的结节处，使用无菌棉签将组织从镊子擦到铰链，同时沿着小叶旋转拭子。擦拭后，冲洗胶原酶溶液管中的拭子，并如刚才所示擦拭组织的另一侧。

冲洗后，在组织两侧重复拭子，并使用一毫升移液管和胶原酶溶液将小叶表面两侧的任何脱落细胞冲洗到培养皿中。冲洗后，将所有溶液从培养皿转移到含有拭子细胞的管中，并将剩余的瓣膜组织放入含有7毫升无菌胶原酶溶液的新15毫升锥形管中。通过离心沉淀分离的瓣膜内皮细胞，并将细胞沉淀重悬于三毫升血管内皮细胞生长培养基中。

第二次离心后，将细胞重悬于一毫升新鲜生长培养基中以进行计数，并以每平方厘米5 x 10至第五个细胞浓度将细胞接种在胶原蛋白包被的六孔板中，每三到四天刷新一次培养基。当瓣膜内皮细胞贴片覆盖超过80%的板时，根据细胞的生长速率，以每平方厘米的1.3 x 10到第四个细胞浓度分裂细胞。细胞扩增后，通过对感兴趣的瓣膜内皮细胞标志物进行免疫荧光染色来确认其瓣膜内皮细胞表型。

为了分离瓣膜间质细胞，将含有拭子的管放入细胞培养箱中，将盖子稍微打开12至18小时。在孵育结束时，使用血清移液管轻轻解离组织以确保瓣膜间质细胞释放，并通过70微米过滤器将细胞悬液过滤到50毫升锥形管中。向管中加入七毫升瓣膜间质细胞培养基，并通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于一毫升新鲜瓣膜间质细胞生长培养基中，用于计数，并以每平方厘米第四个细胞的1.3 x 10浓度接种在60毫米直径的组织培养处理的培养皿中。一到两天后，用PBS洗涤培养物两次，并向细胞中加入新鲜培养基。当细胞达到90%汇合度时，用DPBS洗涤培养物两次，并用2至3毫升预热的解离试剂在37摄氏度下处理细胞2至3分钟。

当细胞分离时，将细胞悬液转移到锥形管中进行离心，并将沉淀轻轻重悬于三至四毫升预热的瓣膜间质细胞生长培养基中进行计数。然后以与原始培养密度的1-2比例接种细胞，并通过免疫荧光染色评估瓣膜间质细胞生长表型，如图所示。与对照组未钙化组织样本相比，钙化性主动脉瓣疾病组织样本表现出形态改变，伴有严重的钙化结节。

当通过Von Kossa染色评估钙化时，在患病的小叶组织中观察到深棕色或黑色沉淀。冷藏溶液极大地稳定了切除的瓣膜组织细胞，在瓣膜提取后长达 61 小时内，两种类型的回收细胞的活力约为 40%。瓣膜内皮细胞的形态学分析显示填充的鹅卵石样生长接触抑制细胞，而瓣膜间质细胞表现出类似于肌成纤维细胞观察到的纺锤形形态。

免疫染色证实，大多数扩增的瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞表达预期的组织特异性标志物。请记住，轻柔但牢固地擦拭小叶对于内皮细胞层的释放至关重要，并且需要与胶原酶一起孵育过夜才能从致密组织内部释放间质细胞群。一旦细胞系建立，它们可用于有关特定主动脉瓣疾病发病机制的力学研究，包括疾病的发作、进展和治疗。