이 방법을 통해 연구원은 여러 환자 세포주의 세포 수축을 동시에 연구 할 수 있습니다. 그것은 우리가 질병을 더 빠르고 효율적으로 연구 할 수있게 해줍니다. 이 기술을 통해 실시간으로 세포 수축을 정량화 할 수 있습니다.
한 시간 안에 수십 개의 세포의 수축 값을 얻을 수 있습니다. 우리는 대동맥류 환자 그룹에서 근육 세포 수축이 감소한다는 것을 처음으로 시연했습니다. 이는 의학적 치료를 위한 새로운 바이오마커 또는 표적일 수 있다.
두 쌍의 외과 용 포셉과 메스를 70 % 에탄올에 담그고 건조시켜 멸균하십시오. 그런 다음 조직 해부가 수행 될 페트리 접시에 SMC 배지 두 밀리리터를 피펫하십시오. 다음 피펫 2.5 밀리리터의 SMC 배지를 두 개의 T-25 플라스크에 넣습니다.
작은 양의 매체가 전체 표면을 덮을 수 있도록 플라스크를 소용돌이 치십시오. 육안으로 생검을 검사하고, 내막 측에 죽상 경화성 플라크가 존재하고 모험적인 쪽에 칙칙한 결합 조직이 존재하여 세 개의 대동맥 층을 식별하여 층을 구별합니다. SMC를 배지에서 분리하려면 먼저 내막 플라크가있는 조직을 위쪽으로 올려 다른 두 층을 제거한 다음 분홍색의 균일 한 내측 층이 보일 때까지 두 번째 포셉으로 조직을 아래로 밀면서 포셉으로 조직에서 당겨서 고체 플라크를 제거하십시오.
이제 조직을 뒤집고 모험 층을 당겨서 동일한 절차를 반복하고,이 레이어가 미디어에서 쉽게 분리되지 않도록하기 위해 필요한만큼 많은 시도에서 보이는 모든 부분을 제거해야합니다. 미디어 층이 분리되면 포셉으로 미디어를 아래로 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 절단하여 손상을 최소화하기 위해 깨끗한 단방향 절단을 만들어 조직을 큐브로 자릅니다. 포셉을 사용하여 T-25 플랙의 상부 분기에 10-20개의 이들 조직 조각을 배치한다.
앞서 기술한 바와 같이 두 쌍의 외과 포셉과 메스를 멸균한 후, 조직 해부가 수행될 페트리 접시에 두 밀리리터의 섬유아세포 배지를 피펫팅한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 섬유 아세포 배지를 두 개의 T-25 플라스크에 피펫하고 플라스크를 소용돌이 치며 작은 양의 배지가 전체 표면을 덮습니다. 눈에 보이는 머리카락이있는 표피를 인식 할 수있는 피부 표면으로 표피를 확인하기 위해 생검을 육안으로 검사 한 다음 반대쪽에서 노란색과 칙칙한 피하 지방을 찾으십시오.
표피와 피하 지방 사이의 층은 생존 가능한 섬유 아세포의 원천 인 진피입니다. 진피에서 섬유아세포를 분리하려면 진피 쪽에 조직을 배치하여 다른 두 층을 제거하여 세 층 모두를 볼 수 있도록 합니다. 그런 다음 포셉으로 조직을 잡고 조직을 손상시키지 않고 하나의 깨끗한 선으로 전체 표피를 잘라냅니다.
이제 조직을 뒤집고 피하 지방과의 경계와 평행한 진피 내에서 절단하여 동일한 절차를 반복하십시오. 진피가 분리되면 조직을 큐브로 자르고 포셉으로 조직을 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 자릅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 T-25 플라스크의 상부 분기에 10 내지 20개의 이들 조직 조각을 배치한다.
자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고, 젤라틴 코팅된 ECIS 플레이트 내의 200 마이크로리터의 SMC 배지에서 웰 당 30, 000 세포의 시딩 밀도로 삼중으로 SMCs를 시드한다. SMCs가 있는 플레이트를 ECIS의 96-웰 홀더에 넣고 세포 배양 인큐베이터에 넣는다. ECIS Applied BioPhysics 소프트웨어를 두 번 클릭하여 프로그램을 열고 설정 버튼을 누릅니다.
모든 전극이 오른쪽 구성이라고 표시된 왼쪽 하단 패널의 홀더와 접촉했는지 확인합니다. 전극이 제대로 연결되지 않은 경우 측정을 시작하기 전에 홀더의 플레이트를 조정하십시오. 이제 배열 유형을 클릭하여 동일한 패널에서 플레이트 유형을 선택하십시오.
다음으로, 두 마이크로 리터 및 150 마이크로 리터 부피로 설정된 두 개의 피펫을 준비하십시오. 자극을 시작하기 전에 소프트웨어에서 Mark를 누르고 주석을 달으십시오. 세포를 자극하려면 뚜껑을 제거하고 인큐베이터 내부의 멸균 표면에 놓습니다.
그런 다음 이오노마이신 작업 용액의 두 마이크로리터를 가능한 한 빨리 각 웰로 피펫팅하여 SMC 수축을 유도한다. 일단 모든 세포가 자극되면, 두 번째 피펫을 사용하여 웰에 배지를 혼합한다. 실험간 측정 재현성을 결정하기 위해, 포함된 모든 대조군 및 환자 세포주에 대한 두 개의 독립적인 측정값을 Bland-Altman 플롯으로 플롯팅하여, 이 방법이 하나의 이상치 세포주를 제외하고는 신뢰 구간 밖의 가변성을 나타내지 않았음을 입증하였다.
동일한 실험으로 시딩되고 동시에 자극 된 두 개의 웰은 실질적으로 동일한 계약 반응 곡선을 보였다. 표시된 반응이 이오노마이신 자극으로 인해 삼투압 스트레스가 아닌 수축인지 여부를 검증하기 위해, 자극 후 배지를 교체하고 세포의 거동을 기록하였으며, 이는 자극된 세포가 다시 전극 위로 퍼지기 시작했음을 보여주었다. 건강하고 확장되지 않은 대동맥류에서 유래된 SMCs의 수축 반응은 복부 대동맥류 환자로부터의 52%의 중간 반응과 비교하여 61%의 중간 반응을 보였다.
대조군의 평균 수축 반응은 정상 값보다 수축 값이 낮은 네 명의 환자를 확인하기 위해 사용되었다. 웨스턴 블롯 분석 및 후속 정량화는 세포가 SMC 마커를 발현한다는 것을 확인하였다. SMC의 증식 능력을 결정하기 위해, Ki67에 대해 qPCR을 수행하였다.
Ki67 발현은 모든 세포에서 검출가능했지만, 수축성 출력과 상관관계가 없었다. 수축을 위해 세포를 자극 할 때, 동시에 너무 많은 우물을 피펫하지 말고 가능한 한 빨리 피펫을 시도했는지 기억하십시오. 이 절차에는 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 우리는 수축에 따라 환자를 나누고 정상 수축을 낮추어 이러한 환자와 흡연과 같은 임상 적 특성과의 연관성을 조사 할 수있었습니다.
