该协议的目标是通过半靶向UPLC-MS / MS方法检测血浆中的酚类代谢物。血浆蛋白用乙醇沉淀，样品浓缩，并在流动相中重新悬浮，然后注射到UPLC设备中。使用在实验室中组装的半靶向文库鉴定化合物，使用PCDL管理器进行代谢组学，软件和不同的免费在线数据库。
我们实施了一种营养干预，包括松饼和饮料配方以及brosimum alicastrum种子粉。在干预结束时，参与者的营养和肌肉减少状态得到改善，血浆的总酚含量增加。但我们需要确定哪些酚类化合物已被吸收并贡献了积极作用。
如果要证明这些植物化学物质的生物活性，鉴定和定量食用富含这些抗氧化剂的食物后被吸收的酚类化合物是一项艰巨的任务，但却是必要的。大多数酚类成分的生物利用度较低，此外，其中不到5%的成分进入时没有结构转化为血浆。大多数经历几种生物转化，如甲基化，磺化或葡萄糖醛酸化。
广泛的研究确定了UPLC-MS和UPLC-MS / MS生物体中最常见的代谢物。然而，很大一部分细菌代谢物没有被报告给缺乏包含其完整信息的数据库。代谢物鉴定因代谢物标准品的成本和商业可用性而变得复杂。
因此，最佳策略可能是非靶向或半靶向MS / MS代谢物分析。该分析依赖于分子特征信息的使用，质荷比单同位素精确质量，同位素分布和碎片化模式。确定化学特性并将其与免费可用的在线数据库进行比较，这些数据库包含食用富含多酚的饮食后在生物流体中鉴定的多酚代谢物。
在本研究中，我们开发了一种半靶向UPLC-MS / MS方法来分析参与营养干预的一组老年人的血浆样本。将血浆样品储存在零下80摄氏度，直到分析。在室温下解冻等离子体样品15分钟或在37摄氏度下解冻5分钟。
将200微升血浆样品置于两毫米微管中，并与1000微升纯乙醇混合。涡旋等离子体样品30秒。将样品以6，580离心力离心5分钟。
离心后，用微量移液管或巴斯德移液器收集上清液，并将其置于新的微管中。保留上清液。将沉淀与1000微升纯乙醇混合，顶点30秒，然后在相同条件下离心。
收集上清液并与第一个上清液混合。使用135 psi的纯氮气从样品中除去乙醇。保持针头与微管顶部一厘米的距离，以防止样品丢失并冲洗，直到样品干燥。
将干样品重悬于100微升的一个中，是乙腈与水的混合物中的一个。通过45微尼龙注射器膜直接过滤到HPLC小瓶微量插入物中，将三微升样品注入装有C 18反相柱的UPLC上。将自动进样器温度设置为 20 摄氏度，将柱式恒温器设置为 25 摄氏度。
将每个样品一式三份注入。用水中0.1%甲酸作为溶剂A，100%乙腈作为溶剂B，将流速设定在每分钟0.4毫米，梯度程序如下，0~1分钟10%B，1~4分钟30%B，4~6分钟38%B，6~8分钟60%B，8~8.5分钟60%B， 8.5 至 9 分钟 10%B. 将质谱仪设置为负模式电离。
使用氮气作为300摄氏度的干燥气体，以每分钟13升的流速。将雾化器压力设置为 30 psi。将毛细管电压设置为 4， 000 伏，将碎片电压设置为 175 伏，将撇油器电压设置为 65 伏。
扫描100至1100 m/z之间的质量，对于质谱，扫描质量在50至1000 m/z之间。将数据采集设置为自动 MS/MS 模式。使用以下参考质量 119.036 和 966.0007。
在科学文献中搜索酚类化合物，酚类代谢物和其他感兴趣的化合物。打开UPLC系统中包含的数据库管理软件。选择“文件”，然后选择“新建个人数据库复合库”（PCDL）。
然后选择，创建新的 PCDL。选择 PCDL LC/MS 代谢组学的类型。设置 PCDL 的名称。
然后选择“创建”。在工具栏中，选择“PCDL”，然后选择“允许编辑”选项。然后单击“查找化合物”按钮。
化合物可以通过两种方式添加到个人库中，首先从仪器的通用库中复制它们。为此，请打开迄今为止数据管理中包含的仪器现有数据库。单击按钮查找化合物。
在单次搜索选项中，输入化合物搜索条件以查找感兴趣的化合物。在化合物结果表中，选择感兴趣的化合物。若要选择多个化合物，请单击第一个化合物，然后按住 Ctrl 键，然后单击每个感兴趣的化合物。
然后，右键单击所有突出显示的化合物，然后选择“追加到PCDL”。在新窗口中，搜索并选择专用的个人数据库文件。标记框包括化合物的光谱（如果存在）。
单击追加按钮。在新对话框中，选择“是”以检查添加的新化合物。选择“否”以继续搜索更多感兴趣的化合物。
其次，如果仪器的通用库中没有新化合物，则可以手动添加这些化合物。为此，专门的个人数据库。打开后，选择“PCDL”，然后选择“允许编辑”选项。
选择编辑化合物选项。单击添加新按钮。在窗口的上半部分，填写新化合物的信息。
填写公式，名称，IUPAC名称，CAS编号，化学蜘蛛ID和其他标识符。使用免费在线图书馆，Chemspider，PubChem和Phenol Explorer中提供的信息来填写新感兴趣化合物的信息。完成后，单击“另存为新”按钮，将新的化合物信息保存在专门的个人数据库中。
对所有感兴趣的化合物重复该过程，以完成专门的个人数据库。使用仪器的定性管理器软件鉴定酚类化合物和酚类代谢物。打开示例文件。
在“色谱图”面板中，选择“定义色谱图”并提取总离子色谱图 TIC、提取的离子色谱图的 MS EIC 和 MS/MS 的 EIC。选择“集成色谱图”选项。在“查找化合物”面板中，选择“按配方查找”选项。
在新窗口中，选择“公式源”，然后选择“数据库斜杠库”选项。找到以前创建的个人数据库，然后单击“打开”。选择公式匹配选项，并将质量匹配公差设置为百万分之五 ppm。
选择负离子选项，仅选择减去 H 对话框。在结果选项中，标记提取 EIC，提取清理的频谱，提取原始频谱，并包括结构化对话框。选择结果筛选器选项。
然后标记警告，如果分数是，则将分数匹配设置为80%，然后标记不匹配，如果分数是，则将分数设置为75%，然后单击通过公式查找化合物以识别样品中感兴趣的化合物。通过血浆样品的半靶向UPLC MS / MS分析鉴定酚类代谢物的分步过程如下图所示。首先，使用自建的PCDL数据库获得总离子色谱图，该数据库包含645种酚类化合物及其代谢物，可从免费的在线数据库获得。
接下来，提取离子色谱图和片段化图，或质量小于5 ppm的离子，获得匹配耐受性。最后，将检测到的峰的同位素分布与理论化合物的同位素分布进行了比较。从该分析中，在血浆样品中共鉴定出25种酚类化合物和代谢物。
为了评估设计方法在识别吸收酚类化合物或其代谢物方面的有效性，分析了在30天干预之前和之后获得的研究参与者的五个样本。通过在治疗前用AUC除以处理后曲线下的面积来计算每种化合物的相对丰度。表四显示了12种苯酚化合物的列表，这些化合物显示，在食用含有溴化蜕粉的30天后，血浆增加。
苯乙酸在处理后仅以较高浓度持续发现的代谢物。甘氨酸、一种糖基化异黄酮和三种羟基苯戊酸在五个样本中的三个样品中增加，但在另外两个样品中减少。Gomisin M2，一种木酚素，仅在营养干预后才在五个样本中的三个中检测到。
其他酚类化合物和代谢物仅在一个样品中发现，并且仅在处理后发现。本文开发的方法表明，在大多数情况下，它非常适合创建它的目标。每次处理的样品简单有效。
实现了UPLC分离和酚类代谢物的半靶向MS/MS鉴定。
