基于斑马鱼和青鳉鱼的成年视锥刺伤损伤模型的再生能力比较分析

刺伤是一种诱导非特异性细胞消融的机械损伤方法。该方法有助于评估脑损伤后RGC的增殖和分化。针头介导的刺伤是一种简单、有效实施的诱导脑损伤的方法。

该方法可以使用一组标准工具应用于许多实验样品。斑马鱼的再生能力使用刺伤损伤模型进行说明。对调节神经元再生的分子机制的新见解有助于中枢神经系统的再生治疗。

首先将麻醉的成年斑马鱼或青鳉鱼放在泡沫塑料托盘上。将鱼直立固定在垂直插入聚苯乙烯泡沫塑料中的两根 30 号针之间。握住鱼体以防止鱼头移动，然后将 30 号针穿过颅骨垂直插入其中一个视顶球的内侧区域。

接下来，将受伤的鱼转移到装有新鲜鱼设施水的鱼缸中。一旦鱼从麻醉中完全恢复，将水箱移动到繁殖系统。将纸巾放在泡沫塑料托盘上，放置麻醉的鱼。

然后通过在臀鳍的两侧垂直插入两根 30 号针来将鱼体固定到位。放置鱼后，从肛门到心脏做一个腹侧切口。通过在每侧插入两根 30 号针来保持心脏可见。

然后用镊子的尖端去除银上皮层。将 30 号针插入心室，保持斜面向上，并使用镊子在心房切开一个切口。接下来，通过按下注射器将PBS推入心房以冲洗心房的血液。

当血液排出并且鳃变白时，停止PBS灌注。之后，取下固定鱼体的针头，并将鱼腹侧朝下固定。切断脊髓并从视顶和端脑上切除颅骨后，切断视神经并解剖大脑。

接下来，将大脑转移到含有一毫升4%多聚甲醛的PBS中的1.5毫升管中，在4摄氏度下固定过夜。在PBS中洗涤固定的大脑三次后，每次五分钟，将大脑转移到1.5毫升的管中，其中一毫升30%体积重量的蔗糖在PBS中作为冷冻保护剂，并在4摄氏度下孵育过夜。通过将 30% 蔗糖与 30 毫升最佳切割温度或 OCT 化合物混合来制备包埋化合物，并将化合物储存在 4 摄氏度。

要冷却一次冷冻机，请将铝块在零下 80 摄氏度下孵育过夜，然后将预冷块放入带盖的聚苯乙烯泡沫塑料盒中以防止变暖。对于冠状切片，通过在显微镜下使用镊子调整方向，将解剖的大脑嵌入冷冻机中。接下来，将冷冻剂放在聚苯乙烯泡沫塑料盒中的预冷铝块上，让OCT化合物冻结并变成白色。

当化合物冻结时，在将冷冻块安装在样品盘上之前，在标本盘上涂抹一小圈OCT化合物。通过将标本盘放入低温恒温器中，冷冻OCT化合物。然后将标本盘放在低温恒温器的标本头上。

设置冷冻块的方向后，修剪 OCT 以删除任何额外的区域。使用低温恒温器在整个光学顶盖上切割 14 微米厚的连续切片，并将载玻片存放在零下 25 摄氏度。评估斑马鱼脑组织中的径向神经胶质细胞或RGC增殖。

大多数RGCs在对侧未受伤半球增殖细胞抗原阴性。在受伤后两天，青鳉顶盖的受伤侧诱导RGC增殖。脑损伤后，用溴脱氧尿苷或BrdU标记评估细胞谱系和RGC分化。

代表性分析显示，受伤的斑马鱼和青鳉鱼在受伤后七天出现新生神经元。刺伤的关键步骤之一是手动针头插入。持续的损伤对于产生可重复的结果是必要的。

荧光染料可有效作为伤口标志物。荧光染料扩散的程度表明刺伤的位置和深度。这种技术可能适用于其他小型鱼类，并且适应青鳉鱼可以比较再生能力。