斑马鱼角膜伤口愈合:从磨损到伤口闭合成像分析

角膜透明度有助于清晰视力。在病理背景下，这种透明度可能是挑战。研究发病机制需要与人体器官高度相似的简单模型。

在这些方面，斑马鱼是一个极好的模型。这是对斑马鱼角膜磨损的第一次详细描述。这种技术是诱导表面进入眼睛的一种简单而快速的方法。

擦伤后可以很容易地进行伤口闭合。此外，可以将化学物质或特定因素添加到罐水中，以研究它们对伤口闭合的影响。由于伤口是手动创建的，因此该方法需要一些练习才能获得一致的结果。

实验前，准备0.02%的三卡因工作溶液。解冻2毫升0.4%储备溶液。加入 40 mL 系统水。

并将溶液放在一个小容器中。通过检查毛刺尖端是否干净来准备好眼科毛刺。如果需要，用湿棉签去除细胞碎片。

在柔软的海绵侧面做一个切口。并用系统水润湿海绵。将海绵放在解剖显微镜的载物台上。

确保有足够的工作空间来使用毛刺。从侧面和上方获得足够的照明，以正确看到眼睛表面。用勺子轻轻地将麻醉的鱼放入海绵上的切口中，头部从海绵表面突出。

用毛刺尖端小心地接近眼表。并开始以圆周运动在眼表面上移动尖端。擦伤完成后，小心地将鱼放入含有镇痛剂的新鲜系统水中以进行恢复。

使用后立即用湿棉签清洁毛刺。在所需的时间点拿起鱼并将其放入0.02%三卡因溶液中。将动物保持在溶液中，直到眼球运动完全停止并且鱼对触摸没有反应。

用勺子将鱼放在培养皿上，然后用镊子握住。用解剖剪刀将鱼斩首。避免在眼部表面划伤。

将组织放入含有0.1M磷酸钠的样品管中。并用干净的缓冲液冲洗，使溶液中没有血液残留。将组织固定在2.5%戊二醛中，在0.1M磷酸钠中在4°C下24小时，除去固定溶液并用0.1M磷酸钠冲洗样品几次。

通过将样品放在解剖板上的0.1M磷酸钠滴上来解剖样品。用细解剖剪刀将头部样品切成两半。或者，通过将细镊子的尖端小心地从眼睛的侧面放入眼窝来收集眼睛。

然后，从眼窝中拉出眼睛并取出多余的组织。将解剖的样品转移到含有0.1M磷酸钠的管中。确保样品管中没有多余的组织，因为它在样品处理过程中可能会粘附在眼睛的顶部。

将安装盘与卡舌放在支架上。以及解剖显微镜底座的支架。用细镊子轻轻地将组织样本放在支架上，角膜朝上。

使用适当的装置用铂金涂覆试样。并将样品储存在室温下直至成像。获取所需放大倍率的图像。

并使用 2000 到 2500 倍的图像进行分析。调整亮度和对比度，以清楚地看到所有细胞边界和微量。并避免图像中过度曝光的区域。

使用斐济 ImageJ 1.53 打开 TIFF 图像。并使用比例尺设置比例。使用线工具创建与比例尺相等的线。

选择"分析"。然后，设置比例。并输入已知距离。

然后，使用"分析"、"工具"菜单打开 ROI 管理器。对于像元大小和圆度，请选择分析、设置测量值、形状描述符。并使用放大镜工具查看放大后的细胞。

使用面工具选择单元格，然后将每个选择添加到 ROI 管理器。最后，测量所选单元格，并保存测量值。要继续进行微量滴定分析，请单击"图像"、"类型"菜单，确保图像为 8 位格式。

然后，使用面工具选择单元格。并通过单击"编辑"清除背景，然后单击"清除外部"。通过选择"处理"、"平滑"将图像平滑一到三次。

并从图像，调整，亮度/对比度中调整亮度和对比度，使微脊尽可能清晰地突出。通过单击"进程"，"过滤器"，"卷积"来卷积图像。并通过单击"处理"，"二进制"，"使二进制"将其转换为二进制。

然后，通过选择"处理"、"二进制"、"骨架化"来镂空黑白图像。使用"分析的骨架"函数测量微量槽参数并保存值。伤口区域在伤口后三小时闭合。

但是伤口边界连接的地方仍然可见。结果显示，在磨损的角膜上皮上，可以在伤口部位旁边的一些细长细胞中观察到微药。在一些外围区域，微脊从细胞中心丢失。

两个外周区域之间的比较显示细长的细胞具有较短的平均微量，表明细胞重排作为对伤害的反应。这些结果表明，细胞形状变化与微岭改性相关，并强调了角膜上皮内伤口反应的异质性。请记住，手术需要训练才能进行均匀且可重复的伤口。

除电子显微镜检查外，组织还可用于组织学，免疫染色和原位杂交。这些将进一步了解伤口愈合过程中的细胞和分子变化。使用斑马鱼拓宽了我们对角膜生物学的了解。

此外，该模型非常适合药理学研究，可用于更多地了解眼睛的进化。