توفر هذه الطريقة معلومات جديدة عن كيفية إنتاج كونيديا معدية من الفطريات المسببة للأمراض الحشرية على نطاق واسع لمكافحة الآفات الحشرية الهامة في النظم الإيكولوجية الزراعية التجارية ، بالنظر إلى الوضع الحالي حيث يتم التخلص التدريجي من معظم المبيدات الحشرية بسبب المخاوف من تأثيرها السام على البيئة وصحة الإنسان. تصف هذه التقنية الطريقة المستخدمة لضمان العائد الأمثل ل EPF conidia أثناء الإنتاج الضخم. وهذه الطريقة مفيدة للإدارة المتكاملة للآفات والمكافحة البيولوجية من خلال توفير نظرة ثاقبة على فعالية الكونيديا المنتجة بكميات كبيرة للإدارة الواسعة النطاق للآفات الحشرية الضارة المقاومة للمبيدات الحشرية في النظم الإيكولوجية الزراعية.
تم تطوير هذا الإجراء وإظهاره من قبل الدكتور ليتودي لوكي ماثولوي ، والدكتور نوماخولوا فيث ستوكوي ، والبروفيسور أنطوانيت بولا مالان. سخني لتر واحد من الماء المقطر وأطفئي الحرارة قبل الوصول إلى نقطة الغليان. الآن ، أضف 30 جراما من الجلوكوز ، وأربعة جرامات من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، و 20 جراما من مستخلص الخميرة ، و 15 ملليلتر من خمور الذرة شديدة الانحدار ، واجعل المحتويات تغلي بلطف لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
صب ما مجموعه 100 ملليلتر من الوسط في تسعة قوارير مختلفة 250 ملليلتر. ضع سدادة من الصوف القطني على كل قارورة وقم بتغطية الصوف القطني بورق الألومنيوم كسدادة. قم بتعقيم الوسط في القوارير لمدة 55 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
في وقت لاحق ، اترك الوسط في القوارير ليبرد وأضف 10 ملليغرام لكل ملليلتر من الستربتومايسين إلى الوسط في كل قارورة. اجمع حلقتين إلى ثلاث حلقات بكتيرية من الكونيديا الفطرية من لوحات الثقافة الفطرية التي يتراوح عمرها بين أسبوعين وثلاثة أسابيع لكل من عزلات EPF. انقل الكونيديا الفطرية إلى كل 100 ملليلتر من الوسائط السائلة في قوارير 250 ملليلتر تحت ظروف معقمة وختم القوارير.
احتضان قوارير المستنبتة السائلة عند حوالي 25 درجة مئوية على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام ووقف الحضانة بمجرد أن تظهر الثقافات علامات على التعكر العالي مع نمو الأروميات الفطرية. للكشف عن أي تلوث بكتيري محتمل من الثقافات ، اسحب عينة من 100 ميكرولتر من كل قارورة مستنبتة سائلة بعد 24 ساعة من الحضانة وطبقها على ثلاث لوحات SDA لكل عزلة. احتضن الألواح لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة يتم التحكم فيها تزيد أو تقل عن 25 درجة مئوية.
استخدم أنبوب نفايات صغير من كلوريد البولي فينيل لإنشاء عنق لكيس التخمير في الطرف المفتوح من كيس الأوتوكلاف واستخدم شريط الأوتوكلاف لتأمين الأنبوب. أغلق الأنبوب بقابس من الصوف القطني المعقم للسماح بتبادل الغاز بشكل كاف أثناء التخمير. استخدم الأرز الأبيض طويل الحبة المسلوق كوسيط ركيزة صلب للأبواسير الأرومية لكل من Metarhizium pinghaense و Metarhizium robertsii.
لكل كيس تخمير ، أضف كيلوغراما واحدا من الأرز و 300 ملليلتر من الماء المقطر المعقم. امزج بلطف محتويات أكياس التخمير. ضعها في أكياس الأوتوكلاف الخارجية في وضع مستقيم وأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 55 دقيقة.
بعد التعقيم ، اسمح للركائز بالتبريد لمدة 45 دقيقة تقريبا في ظل ظروف معقمة. قم بإزالة إغلاق كل من قوارير الثقافة السائلة لكل من Metarhizium pinghaense و Metarhizium robertsii تحت تدفق صفائحي وقم بإشعال حافة كل قارورة لمدة 10 ثوان. صب 100 ملليلتر من الثقافات السائلة في أكياس التخمير عن طريق إزالة سدادات الصوف القطني من أعناقهم.
ضع سدادات القطن مرة أخرى وقم بتغطية الجزء العلوي من عنق الحقيبة بورق جراحي مثبت بشريط مطاطي. قم بلف الجزء العلوي من الحقيبة وامزج محتويات الحقيبة عن طريق هز الركيزة والتلاعب بها عن طريق التدليك. احتضان الأكياس عند حوالي 25 درجة مئوية عن طريق تسطيح الركيزة في الأكياس لمنع تكوين أسرة سميكة.
بعد يومين إلى ثلاثة أيام من التلقيح والحضانة ، عندما حدث نمو فطري مرئي وربط الركيزة بواسطة الفطريات ، كسر الركيزة في أكياس التخمير عن طريق تدليك محتويات الأكياس. بعد التخمير ، انقل الثقافات الجراثيمية إلى أكياس ورقية بنية بوزن 26 إلى 30 كيلوغراما وجفف الثقافات الفطرية لمدة 10 إلى 12 يوما قبل استخدامها في التجارب. لتحسين قوة الشد للأكياس الورقية ، قم بقطع 1/3 أفقيا من الجزء العلوي من الكيس وخط الجزء السفلي من الحقيبة.
تفتت بلطف الركيزة في كل كيس تخمير. اقطع زاوية كل كيس وانقل الثقافة بأكملها ببطء إلى الأكياس الورقية من خلال المساحة التي تتركها الزاوية المقطوعة. قم بتسمية كل كيس ورقي ، وطويه على الطرف العلوي من كل كيس مرتين ، وأغلق بالدبابيس لإنشاء هيكل خيمة مثلث.
ضع الأكياس على رفوف تجفيف سلكية للسماح بالتجفيف السليم ، حتى عند درجة حرارة يتم التحكم فيها تبلغ حوالي 25 درجة مئوية ورطوبة منخفضة تتراوح من 30 إلى 40٪ حصاد كونيديا فطرية من الثقافات باستخدام ثلاثة غربال متداخلة مثبتة على مقلاة تجميع. قم بتحميل عينة المستنبتة الجافة ببطء على شبكة ETS رقم 35 والغربال. ضع غطاء على الغربال لمنع إطلاق الكونيديا الفطرية في الهواء.
أضف 10 إلى 12 من الرخام الزجاجي إلى المناخل للمساعدة في مرور الكونيديا الفطرية عبر الشاشات الشبكية وتجنب الاحتفاظ بالكونيديا في الغربال ، مما قد يؤدي إلى انخفاض استعادة الجراثيم. قم بشريط وختم مفاصل الغربال باستخدام شريط كهربائي. ضع المناخل على شاكر اهتزازي مزود بوسادة لاصقة لتأمين مقلاة التجميع والمناخل لمدة 20 إلى 25 دقيقة بحركة من 560 إلى 640 اهتزازا في الدقيقة.
قم بإزالة غربال الاختبار من مقلاة التجميع ، وجمع الكونيديا ، وتخزين الكونيديا المجمعة في أكياس قفل سحاب محكمة الإغلاق وغير منفذة بالماء للتخزين على المدى الطويل. تم حصاد ما معدله حوالي 1.83 جرام من Metarhizium robertsii conidia الجاف من ركيزة الشعير المقشر ، في حين تم حصاد صفر Metarhizium pinghaense من الركيزة. لم يتم حصاد أي كونيديا فطرية جافة من ركيزة الشوفان المقشر لأي من أنواع Metarhizium.
لوحظ وجود فرق كبير بين نوعين من Metarhizium في المتوسط المقدر للكونيديا لكل غرام يتم حصاده من حبوب الأرز. كان لدى Metarhizium robertsii متوسط عدد كونيديا أعلى قليلا لكل غرام من Metarhizium pinghaense. لم يلاحظ فرق كبير بين نوعين من Metarhizium في العدد التقديري للكونيديا الموجودة على ركيزة الأرز المستهلكة.
ومع ذلك ، كان لدى Metarhizium pinghaense كونيديا أعلى قليلا على ركيزة الأرز من Metarhizium robertsii لا يقدر أي فرق كبير في نوعين من Metarhizium في إجمالي محصول conidia الذي تم الحصول عليه من مزارع ركيزة الأرز. ومع ذلك ، أنتجت Metarhizium pinghaense محصولا كونيديا أعلى قليلا من Metarhizium robertsii ، الذي أنتج عائدا كونيديا أقل. الجزء الصعب من هذه التقنية هو تلوث الركيزة من خلال التلقيح بلقاح blastospores الملوث.
وبالتالي ، تأكد دائما من العقم أثناء العمل. يساعد هذا العرض التوضيحي الطلاب على إعادة إنتاج التقنية بكفاءة دون أخطاء خرقاء يمكن أن تؤدي إلى إنهاء العملية بأكملها.
