Bu yöntem, çoğu insektisitin çevre ve insan sağlığı üzerindeki toksik etkileri nedeniyle aşamalı olarak kaldırıldığı mevcut durum göz önüne alındığında, ticari tarımsal ekosistemlerdeki önemli böcek zararlılarını kontrol etmek için entomopatojenik mantarların enfektif konidiasının nasıl seri üretileceği konusunda yeni bilgiler sunmaktadır. Teknik, seri üretim sırasında EPF konidia'nın optimum verimini sağlamak için kullanılan yöntemi açıklar. Bu yöntem, tarımsal ekosistemlerdeki zararlı böcek öldürücü dirençli böcek zararlılarının büyük ölçekli yönetimi için seri üretilen konidianın etkinliği hakkında fikir vererek entegre haşere yönetimi ve biyolojik kontrol için yararlıdır.
Bu prosedür Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe ve Profesör Antoinette Paula Malan tarafından geliştirilmiş ve gösterilmiştir. Bir litre damıtılmış suyu ısıtın ve kaynama noktasına ulaşmadan önce ısıyı kapatın. Şimdi, 30 gram glikoz, dört gram potasyum fosfat dibazik, 20 gram maya ekstresi, 15 mililitre mısır dik likörü ekleyin ve içeriği iki ila üç dakika boyunca hafifçe kaynatın.
Ortamın toplam 100 mililitresini dokuz farklı 250 mililitrelik şişeye dökün. Her şişeye bir pamuk yünü tapası yerleştirin ve pamuk yününü tıpalı olarak alüminyum folyo ile örtün. Şişelerdeki ortamı 121 santigrat derecede 55 dakika otoklav edin.
Daha sonra, şişelerdeki ortamın soğumasına izin verin ve her şişedeki ortama mililitre streptomisin başına 10 miligram ekleyin. Her iki EPF izolatı için iki ila üç haftalık mantar kültürü plakalarından iki ila üç bakteriyel mantar konidia döngüsü toplayın. Mantar konidiasını steril koşullar altında 250 mililitrelik şişelerdeki her 100 mililitre sıvı ortama aktarın ve şişeleri kapatın.
Sıvı kültür şişelerini üç gün boyunca 140 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde yaklaşık 25 santigrat derecede inkübe edin ve kültürler mantar blastospor büyümesi ile yüksek bulanıklık belirtileri gösterdiğinde inkübasyonu durdurun. Kültürlerden olası herhangi bir bakteriyel kontaminasyonu tespit etmek için, 24 saatlik inkübasyondan sonra her sıvı kültür şişesinden 100 mikrolitrelik bir numune alın ve izole başına üç SDA plakasına plaka koyun. Plakaları 48 saat boyunca artı veya eksi 25 santigrat derece kontrollü bir sıcaklıkta inkübe edin.
Otoklav torbasının açık ucundaki fermantasyon torbası için bir boyun oluşturmak için küçük bir polivinil klorür atık borusu kullanın ve boruyu sabitlemek için otoklav bant kullanın. Fermantasyon sırasında yeterli gaz değişimine izin vermek için boruyu steril bir pamuk yünü tapası ile kapatın. Hem Metarhizium pinghaense hem de Metarhizium robertsii'nin blastosporları için katı bir substrat ortamı olarak kaynatılmış uzun taneli beyaz pirinç kullanın.
Her fermantasyon torbası için bir kilogram pirinç ve 300 mililitre steril damıtılmış su ekleyin. Fermantasyon torbalarının içeriğini yavaşça karıştırın. Bunları dış otoklav torbalarına dik konumda yerleştirin ve 55 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav yapın.
Otoklavlamayı takiben, substratların steril koşullar altında yaklaşık 45 dakika soğumasını bekleyin. Hem Metarhizium pinghaense hem de Metarhizium robertsii'nin sıvı kültür şişelerinin her birinin kapağını laminer bir akış altında çıkarın ve her şişenin kenarını 10 saniye boyunca alevlendirin. Pamuk yünü tapalarını boyunlarından çıkararak fermantasyon torbalarına 100 mililitre sıvı kültür dökün.
Pamuklu tapaları tekrar takın ve torbanın boynunun üst kısmını lastik bir bantla sabitlenmiş cerrahi kağıtla örtün. Torbanın üst kısmını bükün ve substratı masaj yaparak sallayarak ve manipüle ederek torbanın içeriğini karıştırın. Kalın yatakların oluşumunu önlemek için torbalardaki substratı düzleştirerek torbaları yaklaşık 25 santigrat derecede inkübe edin.
Aşılama ve inkübasyondan iki ila üç gün sonra, görünür misel büyümesi ve substratın mantar tarafından bağlanması meydana geldiğinde, torbaların içeriğine masaj yaparak fermantasyon torbalarındaki substratı kırın. Fermantasyonu takiben, sporlanmış kültürleri 26 ila 30 kilogramlık kahverengi kağıt torbalara aktarın ve mantar kültürlerini denemelerde kullanılmadan önce 10 ila 12 gün kurutun. Kağıt torbaların çekme mukavemetini artırmak için, torbanın üst kısmının 1 / 3'ünü yatay olarak kesin ve torbanın altını hizalayın.
Substratı her fermantasyon torbasında yavaşça parçalayın. Her torbanın köşesini kesin ve kesilen köşenin bıraktığı boşluktan tüm kültürü yavaşça kağıt torbalara aktarın. Her kağıt torbayı etiketleyin, her torbanın üst ucunu iki kez katlayın ve üçgen bir çadır yapısı oluşturmak için zımbalarla kapatın.
Yaklaşık 25 santigrat derece kontrollü bir sıcaklıkta ve% 30 ila% 40 düşük nemde düzgün, hatta kurumaya izin vermek için torbaları tel kurutma raflarına yerleştirinBir toplama tavasına monte edilmiş üç iç içe geçmiş elek kullanarak kültürlerden mantar konidia toplayın. Kuru kültür numunesini ETS ağ numarası 35'e yavaşça yükleyin ve eleğin. Mantar konidiasının havaya salınmasını önlemek için elek üzerine bir kapak yerleştirin.
Mantar konidiasının ağ ekranlarından geçişine yardımcı olmak için eleklere 10 ila 12 cam mermer ekleyin ve konidianın elek içinde tutulmasını önleyin, bu da spor iyileşmesinin azalmasına neden olabilir. Elek bağlantılarını elektrik bandı kullanarak bantlayın ve kapatın. Elekleri, toplama tavasını sabitlemek için yapışkan bir ped ile donatılmış titreşimli bir çalkalayıcıya yerleştirin ve dakikada 560 ila 640 titreşimlik bir hareketle 20 ila 25 dakika boyunca elekler.
Test eleklerini toplama tavasından çıkarın, konidia toplayın ve toplanan konidiayı uzun süreli depolama için hava geçirmez ve su geçirimsiz fermuar kilidi torbalarında saklayın. Pul pul dökülmüş arpa substratından ortalama yaklaşık 1.83 gram kuru Metarhizium robertsii conidia hasat edilirken, substrattan sıfır Metarhizium pinghaense hasat edildi. Metarhizium türleri için pul pul yulaf substratından kuru mantar konidiası toplanmamıştır.
Pirinç tanelerinden toplanan gram başına tahmini ortalama konidiada iki Metarhizium türü arasında anlamlı bir fark gözlenmiştir. Metarhizium robertsii, gram başına ortalama konidia sayısı, Metarhizium pinghaense'den biraz daha yüksekti. İki Metarhizium türü arasında, harcanan pirinç substratında bulunan tahmini konidia sayısında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.
Bununla birlikte, Metarhizium pinghaense, pirinç substratı üzerinde Metarhizium robertsii'den biraz daha yüksek konidiaya sahipti İki Metarhizium türünde, pirinç substrat kültürlerinden elde edilen genel konidia veriminde anlamlı bir fark tahmin edilmemektedir. Bununla birlikte, Metarhizium pinghaense, daha düşük bir konidiyal verim üreten Metarhizium robertsii'den biraz daha yüksek bir konidia verimi üretti. Bu tekniğin zorlu kısmı, kontamine blastospores inokulum ile aşılama yoluyla substrat kontaminasyonudur.
Böylece, çalışırken daima sterilite sağlayın. Bu gösterim, öğrencilerin tüm sürecin sona ermesine neden olabilecek beceriksiz hatalar olmadan tekniği verimli bir şekilde yeniden üretmelerine yardımcı olur.
