שיטה זו מספקת מידע חדש על אופן הייצור המוני של קונידיה זיהומית של פטריות אנטומופתוגניות להדברת מזיקים חשובים של חרקים במערכות אקולוגיות אגרו-אקולוגיות מסחריות, בהתחשב במצב הנוכחי שבו רוב קוטלי החרקים מושבתים בהדרגה בשל חששות מהשפעתם הרעילה על הסביבה ועל בריאות האדם. הטכניקה מתארת את השיטה המשמשת להבטחת התשואה האופטימלית של EPF conidia במהלך ייצור המוני. השיטה מסייעת להדברה משולבת של מזיקים והדברה ביולוגית על ידי מתן תובנה לגבי היעילות של קונידיה בייצור המוני לניהול בקנה מידה גדול של מזיקים מזיקים נגד חרקים בעלי עמידות לקוטלי חרקים במערכות האקולוגיות האגרו-אקולוגיות.
הליך זה פותח והודגם על ידי ד"ר לטודי לוקי מת'ולווה, ד"ר נומקהולווה פיית' סטוקווה ופרופסור אנטואנט פאולה מאלן. מחממים ליטר מים מזוקקים ומכבים את החום לפני שמגיעים לנקודת הרתיחה. עכשיו, להוסיף 30 גרם של גלוקוז, ארבעה גרם של אשלגן פוספט dibasic, 20 גרם של תמצית שמרים, 15 מיליליטר של משקאות חריפים תירס תלול, ולהביא את התוכן לרתיחה עדינה במשך שתיים עד שלוש דקות.
יוצקים בסך הכל 100 מיליליטר של המדיום לתשעה צלוחיות שונות של 250 מיליליטר. מניחים תקע צמר גפן על כל בקבוקון ומכסים את צמר הכותנה בנייר אלומיניום כפקק. אוטוקלאב את המדיום בצלוחיות במשך 55 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
מאוחר יותר, אפשרו למדיום בצלוחיות להתקרר ולהוסיף 10 מיליגרם למיליליטר של סטרפטומיצין למדיום בכל בקבוקון. אספו שתיים עד שלוש לולאות חיידקיות של קונידיה פטרייתית מצלחות תרבית פטרייתיות בנות שבועיים עד שלושה שבועות עבור שני מבודדי ה-EPF. מעבירים את הקונידיה הפטרייתית לכל 100 מיליליטר של מדיה נוזלית בבקבוקי 250 מיליליטר בתנאים סטריליים ואוטמים את הצלוחיות.
דוגרים את צלוחיות התרבית הנוזלית בכ-25 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-140 סל"ד למשך שלושה ימים ומפסיקים את הדגירה ברגע שהתרביות מראות סימנים של עכירות גבוהה עם צמיחת בלסטוספור פטרייתית. כדי לזהות כל זיהום חיידקי אפשרי מהתרביות, ציירו דגימה של 100 מיקרוליטרים מכל בקבוקון תרבית נוזלי לאחר 24 שעות של דגירה וצלחת על שלוש צלחות SDA לכל מבודד. דגירה של הצלחות למשך 48 שעות בטמפרטורה מבוקרת של פלוס או מינוס 25 מעלות צלזיוס.
השתמשו בצינור פסולת פוליוויניל כלוריד קטן כדי ליצור צוואר לשקית התסיסה בקצה הפתוח של שקית האוטוקלבה והשתמשו בסרט אוטוקלאב כדי לאבטח את הצינור. סגור את הצינור עם תקע צמר גפן סטרילי כדי לאפשר החלפת גז מספקת במהלך התסיסה. השתמש באורז לבן ארוך גרגרים פרבויל כמדיום מצע מוצק עבור הבלסטוספורים של הן של Metarhizium pinghaense והן של Metarhizium robertsii.
עבור כל שקית תסיסה, להוסיף קילוגרם אחד של אורז ו 300 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. מערבבים בעדינות את תכולת שקיות התסיסה. מניחים אותם בשקיות אוטוקלאב חיצוניות במצב זקוף ואוטוקלבים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות.
לאחר האוטוקלבינג, אפשרו למצעים להתקרר למשך כ-45 דקות בתנאים סטריליים. הסר את הסגירה של כל אחד מצלוחיות התרבית הנוזליות של Metarhizium pinghaense ושל Metarhizium robertsii תחת זרימה למינרית והבהיר את השפה של כל בקבוקון למשך 10 שניות. יוצקים 100 מיליליטרים של תרביות נוזליות לשקיות התסיסה על ידי הסרת תקעי צמר הגפן מצווארם.
מניחים את תקעי הכותנה בחזרה ומכסים את החלק העליון של צוואר השקית בנייר כירורגי מאובטח באמצעות גומייה. סובבו את החלק העליון של התיק וערבבו את תכולת התיק על ידי ניעור ומניפולציה של המצע על ידי עיסוי. דגירה של השקיות בכ-25 מעלות צלזיוס על ידי שיטוח המצע בשקיות כדי למנוע היווצרות של מיטות עבות.
יומיים-שלושה לאחר החיסון והדגירה, כאשר התרחשה צמיחת התפטיר הנראה לעין וקשירת המצע על ידי הפטרייה, שברו את המצע בשקיות התסיסה על ידי עיסוי תכולת השקיות. לאחר התסיסה, מעבירים את התרביות המחורצות לשקיות נייר חומות במשקל 26 עד 30 ק"ג ומייבשים את תרביות הפטריות למשך 10 עד 12 יום לפני השימוש בהן בניסויים. כדי לשפר את חוזק המתיחה של שקיות הנייר, חתכו אופקית 1/3 מהחלק העליון של השקית וריפדו את החלק התחתון של השקית.
מפוררים בעדינות את המצע בכל שקית תסיסה. חותכים את הפינה של כל שקית ומעבירים באיטיות את כל התרבות לשקיות הנייר דרך החלל שהותירה הפינה החתוכה. תייג כל שקית נייר, קפל מעל הקצה העליון של כל שקית פעמיים, וסגור עם סיכות כדי ליצור מבנה אוהל משולש.
מניחים את השקיות על מדפי ייבוש חוטים כדי לאפשר ייבוש נכון, אפילו בטמפרטורה מבוקרת של כ-25 מעלות צלזיוס ולחות נמוכה של 30 עד 40% קונידיה פטרייתית קציר מהתרביות באמצעות שלוש מסננות מקוננות המותקנות על מחבת אוסף. טען באיטיות את דוגמת התרבית היבשה ברשת ETS מספר 35 וסנן. הניחו מכסה על המסננת כדי למנוע שחרור של קונידיה פטרייתית לאוויר.
הוסיפו 10 עד 12 גולות זכוכית למסננות כדי לסייע במעבר הקונידיה הפטרייתית דרך מסכי הרשת ולהימנע משמירה של הקונידיה במסננת, מה שעלול לגרום להתאוששות נבגים מופחתת. להדביק ולאטום את מפרקי המסננת באמצעות סרט חשמלי. מניחים את המסננות על שייקר רוטט המצויד בכרית דביקה כדי לאבטח את מחבת האיסוף והמסננות למשך 20 עד 25 דקות בתנועה של 560 עד 640 רטטים לדקה.
מוציאים את מסננות הבדיקה ממחבת האיסוף, אוספים את הקונידיה ומאחסנים את הקונידיה שנאספה בשקיות אטומות למים עם נעילת רוכסן אטומה למים לאחסון לטווח ארוך. בממוצע של כ-1.83 גרם של Metarhizium robertsii conidia יבש נקטף ממצע השעורה המתקלף, ואילו מהמצע נקטף אפס Metarhizium pinghaense. לא נקטפו קונידיה פטרייתית יבשה ממצע שיבולת השועל המתקלף עבור אף אחד ממיני המטהריזיום.
הבדל משמעותי נצפה בין שני המינים של Metarhizium בקונידיה הממוצעת המשוערת לגרם שנקטפה מגרגרי האורז. ל-Metarhizium robertsii הייתה ספירת קונידיה ממוצעת מעט גבוהה יותר לגרם מאשר ל-Metarhizium pinghaense. לא נצפה הבדל משמעותי בין שני המינים של Metarhizium במספר המשוער של conidia הנוכחים על מצע האורז המבוזבז.
עם זאת, ל-Metarhizium pinghaense הייתה קונידיה מעט גבוהה יותר על מצע האורז מאשר ל-Metarhizium robertsii לא מוערך הבדל משמעותי בשני המינים של Metarhizium בתפוקת הקונידיה הכוללת שלהם שהתקבלה מתרביות מצע האורז. עם זאת, Metarhizium pinghaense הפיק תפוקת קונידיה מעט גבוהה יותר מאשר Metarhizium robertsii, אשר הפיק תשואה conidial נמוך יותר. החלק המאתגר בטכניקה זו הוא זיהום המצע באמצעות חיסון עם אינוקולום בלסטוספורס מזוהם.
לכן, תמיד להבטיח סטריליות תוך כדי עבודה. הדגמה זו מסייעת לתלמידים לשחזר ביעילות את הטכניקה ללא טעויות מגושמות שיכולות לגרום לסיום התהליך כולו.
