在2D培养系统中将人多能干细胞分化为胰腺β细胞前体

这种优化的方案增强了人多能干细胞中胰腺β细胞前体的产生，可用于糖尿病的细胞治疗和研究糖尿病生物发生的分子机制。这是一种可行的技术，因为它用于2D单层培养。它易于应用，并且在多个对照和患者来源的多能干细胞系中保持一致。

这些β细胞前体移植到糖尿病患者中时可以成熟为分泌胰岛素的β细胞，并可能逆转高血糖症。因此，使用我们的方案产生的胰腺祖细胞百分比的增加可用于糖尿病的细胞治疗。这种增强的方案可用于研究健康个体和糖尿病患者的早期人类胰腺发育，由于组织样本短缺，这具有挑战性。

当人多能干细胞或hPSC集落达到70%至80%汇合时，在组织培养罩内用温热的PBS洗涤两次。然后使用便携式真空吸液器吸出缓冲液。接下来，将含有CHIR-99021的第一阶段分化培养基添加到菌落中，并将板在37摄氏度下孵育24小时。

第二天，用不含CHIR-99021的第一阶段分化培养基更换用过的培养基。吸出用过的培养基并用温热的PBS洗涤确定的内胚层细胞两次后，旋转板以去除任何细胞碎片。然后通过添加4%多聚甲醛固定细胞，并将板放在二维摇床上。

固定后，用含有0.5%吐温的TRIS缓冲盐水洗涤细胞，并将板放在摇床上。然后通过添加含有0.5%Triton X-100的大量PBS来透化固定细胞，并将板放回摇床上。接下来，将新鲜制备的封闭缓冲液添加到透化细胞中，并将板在摇床上孵育一小时。

然后将稀释的一抗添加到封闭的细胞中，并将平板放在四摄氏度的摇床上，轻轻摇动。第二天吸出一抗溶液后，用TBST在摇床上洗涤孔三次，每次10分钟。接下来，添加二抗。

用铝箔盖住板以防止光线照射，并将板在室温下放在振动台上一小时。然后吸出二抗溶液，并在摇床上用TBST洗涤染色孔10分钟，保持板用箔纸覆盖。接下来，要染色细胞核，将Hoechst溶液添加到孔中并将板放在摇床上。

两到三分钟后，吸出Hoechst溶液并用PBS冲洗孔两次。最后，将PBS添加到染色细胞中，并在黑暗中使用倒置荧光显微镜对其进行成像。在第二阶段的第一天，首先用温热的PBS洗涤hPSC衍生的内胚层细胞，然后在六孔板的每孔中加入一毫升温热的酶溶液，从而解离hPSC衍生的内胚层细胞。

将板置于37摄氏度和5%二氧化碳下三到五分钟或直到细胞开始彼此分离。解离孔中分离的片或单层细胞，并使用基底阶段半培养基将分离的细胞收集在15毫升聚丙烯管中。然后旋转细胞，弃去上清液，并使用一毫升无菌PBS重悬沉淀。

使用自动计数器计数细胞后，再次旋转细胞，并丢弃上清液。然后将沉淀重悬于含有Rock抑制剂的第二阶段分化培养基的适当体积中。将重悬的细胞铺在1至50个膜基质涂层板上，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。

24小时后，用不含Rock抑制剂的第二阶段分化培养基更换培养基。在第四阶段结束时，如前所述分离细胞，并将它们收集在15毫升的管中。然后旋转细胞，弃去上清液，用PBS洗涤细胞，并将它们解离成单个细胞。

使用自动细胞计数器计数细胞后，再次旋转细胞并将沉淀重悬于200微升冷冻PBS中。接下来，加入两毫升冷冻的80%乙醇滴液，将管子放在低速至中速的涡旋上。盖紧盖子，将管子稍微倾斜放在摇床上，温度为四摄氏度过夜。

第二天，旋转细胞并用PBS洗涤沉淀以解离任何固定细胞团块。然后在室温下将固定细胞封闭至少一小时或在摇床上过夜四摄氏度。接下来，要对胰腺祖细胞标志物进行染色，在 96 孔 V 底板中为每个条件分配 200， 000 个细胞，包括适当的同种型对照、未染色和二抗对照。

然后短暂旋转板，并以快速的动作翻转板以丢弃上清液而不会丢失颗粒。接下来，将一抗中的细胞在室温下在摇床上轻轻摇动孵育至少两个小时。然后通过在孔中上下移液，用TBST洗涤染色细胞三次。

再次离心细胞，弃去上清液，并向细胞中添加二抗。在室温下孵育30分钟后，用TBST洗涤染色细胞两次。然后旋转板，将染色细胞收集在100微升PBS中，放在防光传真管中，并在流式细胞仪上运行样品。

与非优化方法相比，优化的方案通过上调PDX 1和NKX 6.1共表达提高了胰腺祖细胞分化效率。特别是，与非解离方案相比，内胚层细胞的解离及其在新鲜膜基质上的重新铺板，以及更长的第三阶段持续时间，增强了hPSC衍生胰腺祖细胞中NKX 6.1的表达。与非解离方法相比，使用优化方案生成的胰腺祖细胞也增加了SOX9阳性细胞的数量。

此外，优化的方法还产生了更高比例的增殖NKX 6.1阳性细胞，这些细胞共表达增殖标志物Ki67。为了提高效率，至关重要的是解离HbA1衍生的内胚层，然后延长FGF淀粉样蛋白信号传导和刺猬抑制的第三阶段治疗的持续时间。使用这种增强方案的胰腺祖细胞的可扩展生成促进了提高人类多能干细胞来源的胰腺β细胞的效率和成熟的研究，并允许对不同类型的糖尿病进行建模。