Этот оптимизированный протокол улучшил генерацию предшественников бета-клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток человека, которые могут быть использованы для клеточной терапии диабета и исследования молекулярных механизмов, подчеркивающих биогенез диабета. Это осуществимый метод, поскольку он используется для 2D монослойных культур. Он прост в применении и согласован с несколькими контрольными и полученными от пациента линиями плюрипотентных стволовых клеток.
Эти предшественники бета-клеток при трансплантации у пациента с диабетом могут созревать в инсулин, секретирующие бета-клетки, и потенциально могут обратить вспять гипергликемию. Таким образом, повышенный процент предшественников поджелудочной железы, генерируемых с помощью нашего протокола, может быть использован для клеточной терапии диабета. Этот расширенный протокол может быть использован для изучения раннего развития поджелудочной железы человека у здоровых людей, а также у пациентов с диабетом, что является сложной задачей из-за нехватки образцов тканей.
Когда человеческие плюрипотентные стволовые клетки или колонии hPSC достигнут слияния от 70 до 80%, дважды промыть их теплым PBS внутри вытяжки культуры тканей. Затем аспирируйте буфер с помощью портативного вакуумного аспиратора. Затем добавьте к колониям среду дифференцировки первой стадии, содержащую CHIR-99021, и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.
На следующий день замените отработанную среду на среду дифференциации первого этапа без CHIR-99021. После аспирации отработанной среды и промывки окончательных клеток энтодермы дважды теплым PBS, закрутите пластину, чтобы удалить любой клеточный мусор. Затем зафиксируйте клетки, добавив 4% параформальдегида, и поместите пластину на двумерный шейкер.
После фиксации промыть клетки TRIS-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,5% анимации, и поместить пластину на шейкер. Затем пропитайте фиксированные ячейки, добавив щедрое количество PBS, содержащего 0,5% Triton X-100, и поместите пластину обратно на шейкер. Затем добавьте свежеприготовленный блокирующий буфер к пермеабилизированным клеткам и высиживайте пластину в течение одного часа на шейкере.
Затем добавьте разбавленные первичные антитела к заблокированным клеткам и поместите пластину на шейкер при четырех градусах Цельсия с легким встряхиванием. На следующий день после аспирации раствора первичного антитела промыть лунки три раза TBST в течение 10 минут каждый на шейкере. Далее добавляют вторичные антитела.
Накройте пластину алюминиевой фольгой для защиты от света, и поместите пластину на шейкер при комнатной температуре на один час. Затем аспирировать раствор вторичного антитела и промыть окрашенные лунки TBST на шейкере в течение 10 минут, держа пластину покрытой фольгой. Далее, чтобы окрасить ядра, добавьте раствор Hoechst в лунки и поместите пластину на шейкер.
Через две-три минуты аспирировать раствор Hoechst и дважды промыть лунки PBS. Наконец, добавьте PBS к окрашенным клеткам и визуализируйте их с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа в темноте. В первый день второго этапа диссоциируют эндодермальные клетки, полученные из hPSC, сначала промывая их теплым PBS, а затем добавляя один миллилитр теплого раствора фермента на лунку из шестилуночной пластины.
Поместите пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех-пяти минут или до тех пор, пока клетки не начнут отделяться друг от друга. Диссоциируют отсоединенные листы или монослой ячеек в колодцах и собирают отсоединенные ячейки вместе в 15-миллилитровую полипропиленовую трубку с использованием базальной полусреды стадии. Затем раскрутите клетки вниз, выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу, используя один миллилитр стерильного PBS.
После подсчета клеток с помощью автоматизированного счетчика снова раскрутите ячейки и выбросьте супернатант. Затем повторно суспендируют гранулу в соответствующем объеме среды дифференцировки второй стадии, содержащей ингибитор породы. Обложите повторно суспендированные клетки на одной до 50 пластин с мембранным матричным покрытием и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Через 24 часа заменить среду средой дифференцировки второй стадии без ингибитора Рока. В конце четвертого этапа отсоедините клетки, как было показано ранее, и соберите их в 15-миллилитровую трубку. Затем раскрутите клетки, выбросьте супернатант, промыте клетки PBS и диссоциируйте их на отдельные клетки.
После подсчета клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток снова раскрутите ячейки и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах охлажденного PBS. Затем добавьте два миллилитра охлажденного 80% этанола с помощью трубки на вихре, установленной на низкой и средней скорости. Плотно закройте колпачок и поместите трубку слегка наклоненной на шейкер при четырех градусах Цельсия на ночь.
На следующий день раскрутите клетки и промыте гранулу PBS, чтобы диссоциировать любые скопления фиксированных клеток. Затем блокируйте фиксированные ячейки в течение не менее одного часа при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия на ночь на шейкере. Затем, чтобы окрасить маркеры предшественника поджелудочной железы, распределите 200 000 клеток на состояние, включая соответствующие элементы контроля изотипа, неокрашенные и вторичные антитела в нижней пластине 96 В.
Затем вращайте пластину ненадолго и переверните пластину быстрым движением, чтобы выбросить супернатант без потери гранул. Далее инкубируют клетки в первичных антителах не менее двух часов при комнатной температуре на шейкере с легким встряхиванием. Затем промыть окрашенные ячейки три раза с помощью TBST путем пипетки вверх и вниз в колодцах.
Центрифугируйте клетки снова, отбрасывайте супернатант и добавляйте вторичные антитела к клеткам. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре дважды промыть окрашенные клетки TBST. Затем раскрутите пластину, соберите окрашенные ячейки в 100 микролитрах PBS в защищенных от света факсимильных трубках и запустите образцы на машине проточной цитометрии.
По сравнению с неоптимизированным методом, оптимизированный протокол повысил эффективность дифференциации предшественников поджелудочной железы за счет повышения коэкспрессии PDX 1 и NKX 6.1. В частности, диссоциация эндодермальных клеток и их повторное покрытие на свежем мембранном матриксе, наряду с большей продолжительностью третьей стадии, усиливали экспрессию NKX 6.1 у гениторов поджелудочной железы, полученных из hPSC, по сравнению с недиссоциированным протоколом. Предшественники поджелудочной железы, генерируемые с использованием оптимизированного протокола, также увеличили количество положительных клеток SOX9 по сравнению с недиссоциированным методом.
Кроме того, оптимизированный метод также генерировал более высокую долю пролиферативных NKX 6.1 положительных клеток, которые совместно экспрессировали маркер пролиферации Ki67. Чтобы повысить эффективность, крайне важно диссоциировать эндодерму, полученную из HbA1, а затем продлить продолжительность третьей стадии обработки с помощью FGF амилоидной сигнализации и ингибирования Hedgehog. Масштабируемая генерация прародителей поджелудочной железы с использованием этого расширенного протокола облегчила исследования по повышению эффективности и созревания бета-клеток поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, и позволила смоделировать различные типы диабета.
