이 최적화된 프로토콜은 인간 만능 줄기 세포로부터 췌장 베타 세포 전구체의 생성을 향상시켰으며, 이는 당뇨병에 대한 세포 치료 및 당뇨병 생물 발생을 강조하는 분자 메커니즘 조사에 사용될 수 있습니다. 이것은 2D 단층 배양에 사용되므로 실현 가능한 기술입니다. 적용하기 쉽고 여러 대조군 및 환자 유래 만능 줄기 세포주에서 일관됩니다.
이러한 베타 세포 전구체는 당뇨병 환자에게 이식될 때 인슐린 분비 베타 세포로 성숙할 수 있으며 잠재적으로 고혈당증을 역전시킬 수 있습니다. 따라서, 우리의 프로토콜을 사용하여 생성 된 췌장 전구 세포의 증가 된 비율은 당뇨병에 대한 세포 치료에 사용될 수 있습니다. 이 향상된 프로토콜은 조직 샘플 부족으로 인해 어려운 당뇨병 환자뿐만 아니라 건강한 개인의 초기 인간 췌장 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
인간 다 능성 줄기 세포 또는 hPSC 콜로니가 70-80 % 합류에 도달하면 조직 배양 후드 내부의 따뜻한 PBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 휴대용 진공 흡인기를 사용하여 버퍼를 흡입합니다. 다음으로, CHIR-99021을 함유하는 1단계 분화 배지를 콜로니에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한다.
다음날, 사용한 배지를 CHIR-99021이 없는 1단계 분화 배지로 교체하십시오. 사용한 배지를 흡인하고 최종 내배엽 세포를 따뜻한 PBS로 두 번 세척한 후 플레이트를 소용돌이쳐 세포 파편을 제거합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드를 추가하여 세포를 고정하고 플레이트를 2차원 셰이커에 놓습니다.
고정 후, 0.5% Tween을 함유하는 TRIS 완충 식염수로 세포를 세척하고, 플레이트를 쉐이커에 놓는다. 그런 다음 0.5% Triton X-100을 포함하는 넉넉한 양의 PBS를 추가하여 고정된 세포를 투과시키고 플레이트를 셰이커에 다시 놓습니다. 다음으로, 새로 준비된 차단 완충액을 투과화된 세포에 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 희석 된 1 차 항체를 차단 된 세포에 넣고 부드럽게 흔들면서 섭씨 4도에서 셰이커에 플레이트를 놓습니다. 다음날 1차 항체 용액을 흡인한 후 웰을 TBST로 셰이커에서 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 다음으로 2 차 항체를 추가하십시오.
빛으로부터 보호하기 위해 접시를 알루미늄 호일로 덮고 접시를 실온에서 1시간 동안 셰이커에 놓습니다. 그런 다음 2 차 항체 용액을 흡인하고 플레이트를 호일로 덮은 상태로 쉐이커에서 TBST로 염색 된 웰을 10 분 동안 세척합니다. 다음으로, 핵을 염색하기 위해, Hoechst 용액을 웰에 첨가하고 플레이트를 셰이커에 놓습니다.
2-3 분 후, Hoechst 용액을 흡인하고 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다. 마지막으로 염색된 세포에 PBS를 추가하고 어두운 곳에서 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 2단계 첫째 날, hPSC 유래 내배엽 세포를 먼저 따뜻한 PBS로 세척한 다음 6웰 플레이트의 웰당 따뜻한 효소 용액 1밀리리터를 추가하여 해리합니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3-5분 동안 또는 세포가 서로 분리되기 시작할 때까지 놓습니다. 웰에서 분리 된 시트 또는 단층의 세포를 해리하고 기저 단계 하프 배지를 사용하여 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에서 분리 된 세포를 함께 수집합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운하고 상청액을 버리고 1밀리리터의 멸균 PBS를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.
자동 카운터를 사용하여 세포를 계수한 후 세포를 다시 회전시키고 상청액을 버립니다. 그런 다음 암석 억제제를 함유하는 적절한 부피의 2단계 분화 배지에 펠릿을 재현탁시킨다. 재현탁된 세포를 1 내지 50개의 멤브레인 매트릭스 코팅된 플레이트에 플레이팅하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양한다.
24시간 후, 암석 억제제가 없는 2단계 분화 배지로 배지를 교체합니다. 4 단계가 끝나면 앞에서 설명한대로 세포를 분리하고 15 밀리리터 튜브에 수집합니다. 그런 다음 세포를 회전시키고 상청액을 버리고 PBS로 세포를 씻고 단일 세포로 해리시킵니다.
자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계수한 후 세포를 다시 회전시키고 200마이크로리터의 냉각된 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 냉각 된 80 % 에탄올을 저속에서 중간 속도로 설정된 와류에 튜브와 함께 현명하게 떨어 뜨립니다. 캡을 단단히 닫고 셰이커에 약간 기울어진 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 놓습니다.
다음날 세포를 회전시키고 PBS로 펠릿을 세척하여 고정 된 세포 덩어리를 해리시킵니다. 그런 다음 고정 된 셀을 실온 또는 섭씨 4도에서 밤새 적어도 1 시간 동안 쉐이커에서 차단하십시오. 다음으로, 췌장 전구체 마커에 대한 염색을 위해, 적절한 이소타입 대조군, 염색되지 않은, 및 2차 항체 대조군을 포함하는 조건당 200, 000개의 세포를 96 웰 V 바닥 플레이트에 분배한다.
그런 다음 플레이트를 짧게 돌리고 빠른 동작으로 플레이트를 뒤집어 펠릿을 잃지 않고 상청액을 버립니다. 다음으로, 세포를 1차 항체 중 실온에서 적어도 2시간 동안 진탕기에서 부드럽게 진탕하면서 배양한다. 그런 다음 염색된 세포를 웰에서 위아래로 피펫팅하여 TBST로 3회 세척합니다.
세포를 다시 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포에 2차 항체를 첨가한다. 실온에서 30분간 배양한 후, 염색된 세포를 TBST로 2회 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 회전시키고 염색된 세포를 100 마이크로리터의 PBS로 빛보호된 팩스 튜브에 수집하고 유세포분석 기계에서 샘플을 실행합니다.
최적화되지 않은 방법과 비교하여 최적화된 프로토콜은 PDX 1 및 NKX 6.1 동시 발현을 상향조절하여 췌장 전구체 분화 효율을 향상시켰습니다. 특히, 내배엽 세포의 분리와 신선한 막 기질에서의 재 도금은 3 단계의 더 긴 지속 시간과 함께 비 해리 프로토콜에 비해 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 NKX 6.1 발현을 향상 시켰습니다. 최적화된 프로토콜을 사용하여 생성된 췌장 전구세포는 또한 해리되지 않은 방법에 비해 SOX9 양성 세포의 수를 증가시켰습니다.
또한, 최적화된 방법은 또한 증식 마커 Ki67을 동시 발현하는 증식성 NKX 6.1 양성 세포의 더 높은 비율을 생성하였다. 효율성을 높이기 위해서는 HbA1 유래 내배엽을 해리시킨 다음 FGF 아밀로이드 신호 전달 및 고슴도치 억제로 3 단계 치료 기간을 연장하는 것이 중요합니다. 이 향상된 프로토콜을 사용하여 확장 가능한 췌장 전구 세포의 생성은 인간 다 능성 줄기 세포 유래 췌장 베타 세포의 효율성과 성숙을 개선하는 연구를 촉진하고 다양한 유형의 당뇨병을 모델링 할 수있었습니다.
