Questo protocollo ottimizzato ha migliorato la generazione di precursori delle cellule beta pancreatiche da cellule staminali pluripotenti umane, che possono essere utilizzate per la terapia cellulare per il diabete e lo studio dei meccanismi molecolari alla base della biogenesi del diabete. Questa è una tecnica fattibile in quanto viene utilizzata per le colture monostrato 2D. È facile da applicare ed è coerente tra più linee di cellule staminali pluripotenti di controllo e derivate dal paziente.
Questi precursori delle cellule beta trapiantati in un paziente diabetico possono maturare in cellule beta che secernono insulina e possono potenzialmente invertire l'iperglicemia. Pertanto, l'aumento delle percentuali di progenitori pancreatici generati utilizzando il nostro protocollo può essere utilizzato per la terapia cellulare per il diabete. Questo protocollo avanzato può essere utilizzato per studiare lo sviluppo pancreatico umano precoce in individui sani e in pazienti diabetici, il che è difficile a causa della carenza di campioni di tessuto.
Quando le cellule staminali pluripotenti umane o le colonie di hPSC hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, lavarle due volte con PBS caldo all'interno del cappuccio di coltura tissutale. Quindi aspirare il tampone utilizzando un aspiratore a vuoto portatile. Quindi, aggiungere il mezzo di differenziazione dello stadio uno contenente CHIR-99021 alle colonie e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, sostituire il supporto esaurito con il mezzo di differenziazione della fase uno senza CHIR-99021. Dopo aver aspirato il mezzo esaurito e lavato due volte le cellule dell'endoderma definitivo con PBS caldo, ruotare la piastra per rimuovere eventuali detriti cellulari. Quindi fissare le celle aggiungendo il 4% di paraformaldeide e posizionare la piastra su uno shaker bidimensionale.
Dopo la fissazione, lavare le celle con soluzione salina tamponata TRIS contenente 0,5% Tween e posizionare la piastra sullo shaker. Quindi permeabilizzare le celle fisse aggiungendo una generosa quantità di PBS contenente lo 0,5% di Triton X-100 e riposizionare la piastra sullo shaker. Quindi, aggiungere tampone bloccante appena preparato alle cellule permeabilizzate e incubare la piastra per un'ora sullo shaker.
Quindi aggiungere anticorpi primari diluiti alle cellule bloccate e posizionare la piastra sullo shaker a quattro gradi Celsius con un leggero scuotimento. Il giorno seguente dopo aver aspirato la soluzione di anticorpi primari, lavare i pozzetti tre volte con TBST per 10 minuti ciascuno sullo shaker. Quindi, aggiungi gli anticorpi secondari.
Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e posizionare la piastra sullo shaker a temperatura ambiente per un'ora. Quindi aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare i pozzetti macchiati con TBST sullo shaker per 10 minuti, mantenendo la piastra coperta con un foglio. Successivamente, per colorare i nuclei, aggiungere la soluzione di Hoechst ai pozzetti e posizionare la piastra sullo shaker.
Dopo due o tre minuti, aspirare la soluzione di Hoechst e sciacquare i pozzetti due volte con PBS. Infine, aggiungi PBS alle cellule colorate e visualizzale usando un microscopio a fluorescenza invertita al buio. Il primo giorno della seconda fase, dissociare le cellule endodermiche derivate da hPSC lavandole prima con PBS caldo e quindi aggiungendo un millilitro di soluzione enzimatica calda per pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre-cinque minuti o fino a quando le cellule iniziano a staccarsi l'una dall'altra. Dissociare i fogli staccati o il monostrato di cellule nei pozzetti e raccogliere le celle staccate insieme in un tubo di polipropilene da 15 millilitri utilizzando il mezzo media dello stadio basale. Quindi ruotare le cellule verso il basso, scartare il surnatante e risospendere il pellet usando un millilitro di PBS sterile.
Dopo aver contato le celle usando un contatore automatico, ruotare di nuovo le celle e scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet nel volume appropriato del mezzo di differenziazione dello stadio due contenente un inibitore di Rock. Placcare le cellule risospese su una a 50 piastre rivestite di matrice di membrana e incubarle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione di fase due senza l'inibitore di Rock. Alla fine della quarta fase, staccare le cellule come dimostrato in precedenza e raccoglierle in un tubo da 15 millilitri. Quindi ruotare le cellule, scartare il surnatante, lavare le cellule con PBS e dissociarle in singole cellule.
Dopo aver contato le celle utilizzando un contatore automatico delle celle, ruotare nuovamente le celle e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS refrigerato. Quindi, aggiungere due millilitri di etanolo refrigerato all'80% a goccia con il tubo su un vortice impostato a velocità medio-bassa. Chiudere saldamente il tappo e posizionare il tubo leggermente inclinato sullo shaker a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, girare le cellule e lavare il pellet con PBS per dissociare eventuali grumi di cellule fisse. Quindi bloccare le celle fisse per almeno un'ora a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius durante la notte sullo shaker. Successivamente, per colorare i marcatori progenitori pancreatici, distribuire 200.000 cellule per condizione, compresi i controlli isotipi appropriati, i controlli anticorpali non colorati e secondari in una piastra inferiore a V a 96 pozzetti.
Quindi ruotare brevemente la piastra e capovolgere la piastra con un movimento rapido per scartare il surnatante senza perdere i pellet. Quindi, incubare le cellule negli anticorpi primari per almeno due ore a temperatura ambiente su uno shaker con un leggero scuotimento. Quindi lavare le cellule macchiate tre volte con TBST pipettando su e giù nei pozzetti.
Centrifugare nuovamente le cellule, scartare il surnatante e aggiungere anticorpi secondari alle cellule. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule macchiate due volte con TBST. Quindi ruotare la piastra, raccogliere le cellule colorate in 100 microlitri di PBS in tubi fax protetti dalla luce ed eseguire i campioni su una macchina per citometria a flusso.
Rispetto al metodo non ottimizzato, il protocollo ottimizzato ha migliorato l'efficienza di differenziazione dei progenitori pancreatici aumentando la co-espressione di PDX 1 e NKX 6.1. In particolare, la dissociazione delle cellule endodermiche e il loro replating sulla matrice di membrana fresca, insieme a una maggiore durata del terzo stadio, hanno migliorato l'espressione di NKX 6.1 nei progenitori pancreatici derivati da hPSC rispetto al protocollo non dissociato. I progenitori pancreatici generati utilizzando il protocollo ottimizzato hanno anche aumentato il numero di cellule SOX9 positive rispetto al metodo non dissociato.
Inoltre, il metodo ottimizzato ha anche generato una percentuale maggiore di cellule proliferative NKX 6.1 positive che hanno co-espresso il marcatore di proliferazione Ki67. Al fine di migliorare l'efficienza, è fondamentale dissociare l'endoderma derivato da HbA1 e quindi estendere la durata del trattamento di fase tre con segnalazione dell'amiloide FGF e inibizione di Hedgehog. La generazione scalabile di progenitori pancreatici utilizzando questo protocollo avanzato ha facilitato gli studi sul miglioramento dell'efficienza e della maturazione delle cellule beta pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane e ha permesso la modellazione di diversi tipi di diabete.
