使用2'，7'-二氯荧光素双乙酸探针和流式细胞术在穆勒神经胶质细胞中定量活性氧

有几种方法可以测量细胞中的ROS产生或氧化应激。其中，2'7'二氯荧光素二乙酸探针是直接测量氧化还原状态最广泛使用的技术之一。该探针是亲脂性的和非荧光的。该探针在细胞膜上的扩散允许细胞内酯酶在两个酯键处裂解，产生相对极性和细胞膜不渗透的产物。这些非荧光分子在细胞内积聚，随后通过ROS氧化产生高荧光产物二氯荧光素。探针的氧化是多种类型ROS作用的产物。这可以通过流式细胞术或共聚焦显微镜检测。在本文中，我们使用二氯荧光素二乙酸探针通过流式细胞术测量和量化ROS。将6孔板从培养箱转移到层流罩中。吸出上清液。并用PBS洗涤细胞一次。每孔加入 2 mL 低血清 DMEM。并将6孔板在培养箱中孵育两小时。用抗氧化剂处理细胞六小时。用ROS诱导剂A或B处理细胞30分钟。吸出上清液。并用PBS清洗细胞三次，以去除所有刺激。关闭层流罩的灯，在黑暗中工作。在不含酚红的DMEM中加入1mL二氯荧光素二乙酸探针。向对照自发荧光对照细胞中加入1 mL不含酚红的DMEM。将6孔板在培养箱中孵育30分钟。将冰上的板转移到实验室。每孔用2mL冷PBS洗涤细胞三次。向每个孔中加入0.5 mL冷分离缓冲液。通过使用P1000移液器轻轻地上下移液来收获细胞。将它们收集在标记的1.5 mL管中。并在4°C下以600×g离心5分钟，小心地弃去上清液，轻轻地用敲击解离沉淀。加入1mL FACS缓冲液以将细胞洗涤到每个标记的试管中。如有必要，请使用最低强度的涡旋，以完全解离颗粒。在4°C下以600×g离心5分钟，重复此步骤两次。总共三次洗涤。将细胞沉淀重悬于200L FACS缓冲液中。使用涡旋轻轻地完全解离每个管中的沉淀。并转移到标记的5 mL用于流式细胞仪管。将试管保持在冰上，直到在流式细胞仪上进行分析。使用流式细胞术软件，创建一个新的实验。单击试样，将打开试管列表。双击并重命名它们。将自动荧光控制管放在吸气臂上，仅向左小心地移动底座。单击“采集数据”，然后单击“记录数据”，然后选择所需的停止条件。在感兴趣的细胞周围画一个门，排除死细胞和碎片。取下管子。单击“下一管”并运行基础对照样品。单击“采集数据”，然后在“记录数据”中打开软件。使用“添加示例”操作按钮添加示例。单击“添加样品”。选择“实验日期”文件夹，然后单击“选择”。双击工作区中的第一个样品，在本例中为自动荧光控制。绘制多边形门以分离感兴趣的细胞，排除死细胞和碎片。将绘图更改为直方图。在 M 中双击