使用亚细胞室特异性红氧敏感绿色荧光蛋白评估细胞氧化

当前纺织品协议评估员，氧化还原状态变化在细胞内隔间内特定的方式。我们的协议使更好的理解和监测氧化应激的所有生理或病理生理机制。该技术允许使用比率公制输出对完整细胞中的平铺眼硫化物比率进行无中断定量，以平衡信号表达水平、照片漂白和检测敏感性之间的差异。

该协议可应用于各种生物体，包括植物中的细菌。实验的第一天，从汇合乳癌细胞系治疗细胞两分钟，在EDTA中两毫升0.2，5%的行程。当细胞开始分离时，用六毫升的完整介质阻止反应，通过离心沉淀细胞。

将颗粒重新悬浮在五毫升新鲜、完整的介质中，数数细胞，并稀释至每毫升完整介质的1.5倍至第五细胞。然后在6个井中每毫升细胞中播种1.5倍至第5个细胞，并在细胞培养培养箱中孵育细胞。或添加无病毒行 GFP 转导。

第二天早上，加入12.5、25和50微升的1至100微升稀释6倍10至第10个斑块形成单位每毫升添加无病毒侵蚀GP溶液，在完全介质中。将其添加到适当的井或6孔板中，分别以50、100和200倍的感染率对细胞进行转导。当所有样本Well被病毒转导时，将细胞返回细胞培养箱16至24小时。

第二天，通过荧光显微镜将细胞可视化，用介质替换上一代，没有病毒，使细胞恢复24小时。要确定最佳转导效率，通过流式细胞测量评估细胞的荧光强度和形态。请务必在生物安全二级生物安全柜内执行所有可能导致气溶胶或飞溅感染的程序。

为了评估细胞的氧化还原状态，第二天早上，用10微摩尔过氧化氢孵育6井板的细胞和适当的孔，然后分离细胞与750微升0.2 5%滴入EDTA每井，如证明。停止反应与两毫升完整的中等每孔和拉上一种条件在个别15毫升锥形管的超级物。通过离心沉淀细胞，通过离心两次将颗粒洗净到每井500微升PBS中。

第二次洗涤后，通过40微米网格过滤细胞悬浮液，进入冰上流动细胞测量兼容管，防止光线。在流式细胞仪软件中，运行感染控制样本的零多重性。然后分析过氧化氢和未经处理的细胞。

它将允许使用指示公式计算氧化与减少的行 GFP 之间的平均荧光强度比。以下是通过流式细胞学选择大量细胞的浇注策略。流式细胞仪还可用于确定行GP分析的剂量响应曲线和最有效的感染输入的多重性。

根据感染的多重性，剂量反应曲线在此代表性分析中，200多重感染给出了最高的道路GP表达，但细胞形态的影响表明细胞毒性。因此，确定最佳转导效率为100的多重感染。在该氧化还原状态分析中，从车辆流式细胞学分析和四个10微摩尔正控过氧化氢处理中获得氧化和还原行GP平均荧光强度。

叠加的直方图表示 10 微摩尔过氧化氢和车辆处理组或还原和氧化侵蚀 GFP 中细胞数的变化。本分析的氧化排和还原行GP之间的比率计算表明，与车辆处理相比，10微摩尔过氧化氢导致行GP氧化增加三倍。拥有准确的细胞数对于 MRI 计算和可重复性非常重要。

为了获得可重复的结果，研究人员应彻底混合抗病毒溶液，以获得均匀的悬浮液。该协议允许研究人员研究快速氧化还原变化，作为广泛正常细胞过程和疾病进展的一个组成部分的实时。